中性解吸-电喷雾萃取电离质谱直接分析水涝胁迫下烟草的代谢产物

    吴栋 于腾辉 李享 崔萌 郝影宾 刘丽华 罗丽萍

    

    

    

    摘 要 烟草(Nicotiana tabacum L.)是植物科学研究的模式植物和我国重要的经济作物,水涝胁迫是影响烟草品质和产量的重要胁迫因子之一。本研究采用中性解吸-电喷雾萃取电离质谱(ND-EESI-MS)技术,在无需复杂的预处理的条件下,利用烟草中常见的丝氨酸作为优化离子,对萃取剂种类及流速、电喷雾电压、样品端辅助气压、雾化气压和离子传输管温度等仪器参数进行优化。在最优的条件下,共检出水涝胁迫下烟草中丝氨酸、脯氨酸、谷氨酸、丙氨酰甘氨酸、亮氨酸、天冬酰胺、组氨酸、儿茶酚、麦芽酚、肉桂酸、咖啡酸、阿魏酸、白藜芦醇、山奈酚、槲皮素、绿原酸、烟碱、降烟碱、苯乙醛、柠檬醛、苹果酸和β-大马烯酮共22种代谢产物。在应对水涝胁迫时,烟草中脯氨酸、谷氨酸、丝氨酸和组氨酸等初生代谢产物含量增加,绿原酸、阿魏酸、咖啡酸、儿茶酚、苯乙醛、烟碱和降烟碱等次生代谢产物含量也呈上升趋势。本研究从代谢组学层面上揭示水涝胁迫下烟草代谢产物的变化,为进一步了解烟草响应水涝胁迫提供了理论基础。ND-EESI-MS应用于水涝胁迫下烟草中代谢物检测,具有灵敏度高、检测范围广、可实现高通量快速检测等优点,单个样品的测定时间不超过1 min, 为烟草响应水涝胁迫的代谢机理研究提供了新的植物代谢组学技术。

    关键词 中性解吸-电喷雾萃取电离质谱; 烟草; 水涝胁迫; 代谢组学

    1 引 言

    烟草(Nicotiana tabacum L.)为茄科烟草属植物,是研究植物光周期、植物营养、有机物代谢、逆境胁迫和转基因等许多开拓性研究的常用材料[1~3],也是重要的模式植物。烟草中烟碱含量较高,烟碱具有较高的药用和营养价值,对精神分裂症[4]和帕金森综合症[5]等疾病具有一定的疗效。烟草也是我国主要经济作物之一,其中南方地区占94%[6]。烟草生长季节时在南方降雨量较大,烟田地面的积水无法及时排除,导致烟草植株根部缺氧,抑制其生长,多地烟叶生产均受到不同程度水涝胁迫的影响。植物代谢组学不仅可了解植物代谢物的时空积累模式,还能够研究其成分和含量在不同外界环境条件下的变化情况[7],因此可为解析烟草应对水涝胁迫的调控机理提供指引。

    目前,常用于植物代谢组学分析的方法主要有核磁共振法[8]、色谱法[9]和质谱法[10,11]等,关于烟草的代谢组学研究已有报道,如Zhao等[12]采用气相色谱-质谱联用(Gas chromatography-mass spectrometry, GC-MS)和液相色谱-质谱联用(Liquid chromatography-mass spectrometry, LC-MS)的多平台检测技术,对打顶和非打顶烤烟叶中的初生、次生和脂类代谢产物进行了综合研究; Zhao等[13]基于GC-MS和毛细管电泳-飞行时间质谱(Capillary electrophoresis-time-of-flight-mass spectrometry, CE-TOF-MS)考察了烤烟生长状况和环境因素间的关系; Fu等[14]采用超高效液相色谱-质谱联用(Ultraperformance liquid chromatography-tandem mass spectrometry, UPLC-MS)技术对烟草多酚的组成进行检测,发现海拔高度和纬度对烟草叶片中多酚物类质及其抗氧化活性具有一定的影响。

    直接质谱技术指无需进行樣品复杂预处理,可直接对复杂样品进行快速分析的质谱技术,已广泛应用于环境分析、生命科学、食品安全、医学等领域,在代谢组学研究中的应用也越来越广泛[15~18]。中性解吸-电喷雾萃取电离质谱(Neutral desorption-extractive electrospray ionization mass spectrometry,ND-EESI-MS)是由ESI电离源加以改进得到,适用范围更加广泛,可直接对样品中的物质进行解吸化学电离和质谱分析,具有快速、灵敏、实时在线、能够承受复杂基体样品等优点[19, 20]。目前,采用ND-EESI-MS已经实现了对健康和肺癌患者痰样的快速有效区分[21],也实现了蜂蜜中化学污染物的快速、直接质谱检测[22],但植物代谢组学的研究还比较缺乏,且极少有研究针对ND-EESI-MS技术各环节进行优化。

    本研究采用ND-EESI-MS技术对水涝胁迫下烟草代谢组学进行研究,首先对萃取剂、萃取剂流速、电喷雾电压、样品端辅助气压、雾化气压和离子传输管温度等仪器参数进行了优化。在优化条件下,对水涝胁迫下烟草中的代谢产物进行直接质谱检测,共检测到氨基酸、多酚、生物碱等22种代谢产物。本研究建立了一种绿色、原位、快速分析烟草中代谢产物的检测方法,为植物代谢组学研究提供了新方法。

    2 实验部分

    2.1 仪器与试剂

    中性解吸-电喷雾萃取电离源(ND-EESI,江西省质谱科学与仪器重点实验室)[21,22]; LTQ-XL型线性离子阱质谱仪(美国Thermo Fisher公司),配有Xcalibur数据处理系统; Millipore超纯水仪(美国Millipore公司); 手握式单孔打孔机(上海市坚明办公用品有限公司)。甲醇(色谱纯,美国Dikma公司); 丝氨酸、脯氨酸、谷氨酸、亮氨酸、组氨酸标准品(分析纯,上海蓝季科技发展有限公司); 烟碱标准品(百灵威科技有限公司)。

    供试材料为K326烟草种子,为江西及全国广泛种植烤烟品种,由江西省农业技术推广总站提供。

    2.2 实验方法

    2.2.1 烟草样品的准备 选取大小一致的饱满烟草种子(200粒),4℃浸水处理3 d,将种子置于育苗盘培养基(营养土/蛭石/珍珠岩=4∶2∶1,质量比)中,在28℃培养室中避光处理,进行发芽实验。烟草生长至2叶期时移栽,将长势一致的烟草幼苗移栽至花盆(口径100 mm,高90 mm),每盆1株。培养温度为28℃,相对湿度为80%,光照条件为16 h光照/8 h黑暗,光照强度为120 μmol/(m2·s), 培养4周后进行水涝胁迫处理。

    实验分为胁迫处理组和实验对照组,胁迫处理组采用双套盆法,即在盆外侧套不透气塑料袋后置于另一个盆内,胁迫水位维持在高于土壤表面15 mm,分别胁迫1、3、5和7 d,每个处理重复3次。烟草幼苗培养至6叶期,以幼苗自上而下第3或4片完全展开叶为实验检测材料。为规范操作、均匀采样且避免个体差异,用打孔器均匀地在烟草叶片上打孔取样,置于2 mL离心管,每个离心管装12片烟草圆片,置于冰盒中待测。

    2.2.2 实验条件 ND-EESI-MS实验装置原理图和实验参数如图1所示,采用正离子模式检测,样品通道与萃取剂通道夹角α=60°,样品通道口与质谱口的垂直夹角β=150°, 毛细管尖端与质谱口距离d=5.0 mm,鞘气为N2(纯度99.99%),质谱扫描范围为m/z 50~400。碰撞诱导解离(Collision induced dissociation, CID)实验时,母离子隔离宽度为1.2 Da, 碰撞能量为10%~30%,碰撞时间为30 ms。其它参数由LTQ-MS软件系统自动优化。利用N2将样品在EESI环境中进行离子化,通过电场和萃取剂的作用,样品前端产生大量承载待测物的微小带电液滴去溶剂化后得到气态待测物离子,进入到质谱仪中进行检测。

    2.2.3 代谢物的检测 采用优化后的实验条件,对水涝胁迫下烟草叶中代谢产物进行ND-EESI-MS检测。根据文献报道的烟叶成分及质谱检测结果,通过串联质谱排除假阳性结果,对可能的物质进行CID实验,获得二级指纹图谱信息。根据不同的二级碎片以及参考标准品和NIST、PubChem、MassBank质谱数据库进行定性分析,确定烟草叶片中的代谢产物,以烟草中代谢物的指纹图谱信号强度对代谢物含量进行相对定量分析。

    3 结果与讨论

    3.1 实验条件的优化

    3.1.1 萃取剂的优化 分别采用不同萃取剂(水、乙醇、乙醇-水、甲醇、甲醇-水)进行实验条件优化,其中甲醇-水和乙醇-水的体积比均为1∶1,实验结果如图2所示,ND-EESI-MS特征碎片离子(m/z 88)的绝对信号强度在甲醇为萃取剂时最高,考虑到对样品信息尽多地获取,且有些氨基酸物质难溶于有机溶剂,并综合5种萃取剂的萃取效果,选择甲醇-水(1∶1, V/V)进行下一步参数优化。

    3.1.2 電喷雾电压的优化 采用甲醇-水(1∶1,? V/V)作为萃取剂,以丝氨酸的特征碎片离子m/z 88的绝对信号强度为指标进行参数优化。考察电喷雾电压分别为2.0、2.5、3.0、3.5、4.0和4.5 kV的结果,如图3A所示。随着电喷雾电压的增大,m/z 88的信号强度逐渐增大,在4.5 kV时达到最高。但由于质谱仪的电喷雾电压不能过高,未继续增加电压强度,因此本研究采用电喷雾电压为4.5 kV。

    3.1.3 萃取剂流速的优化 分别考察萃取剂流速为2.0、3.0、4.0、5.0、6.0和7.0 μL/min的检测性能,结果如图3B所示。随着萃取剂流速的增大,m/z 88的信号强度先增大后减小,在3.0 μL/min时达到最高,在此流速下质谱信号最佳,故本研究采用萃取剂流速为3.0 μL/min。

    3.1.4 样品端辅助气压的优化 样品端辅助气压分别采用0.4、0.6、0.8、1.0、1.2和1.4 MPa,优化结果如图3C所示。随着气压增大,m/z 88的信号强度呈缓慢上升趋势,变化不明显,其中,在气压为1.0和1.2 MPa时的信号强度相同,1.4 MPa时达到最高。进行多组实验发现,气压为1.2和1.4 MPa时,后期进样的m/z 88的信号不稳定,信号会逐渐变弱。而且样品端辅助气压变化对m/z 88的信号强度影响不明显,因此本研究中样品端辅助气压采用1.0 MPa。

    3.1.5 雾化气压的优化 考察雾化气压分别为0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4和1.6 MPa时对检测的影响,结果如图3D所示。随着气压增大,m/z 88的信号强度呈现先增大后减小的趋势,在1.4 MPa时达到最大,此时质谱效果最佳。因此本实验中雾化气压采用1.4 MPa。

    3.1.6 离子传输管温度的优化 离子传输管温度分别采用100、150、200、250、300和350℃,优化结果如图3E所示,随着离子传输管温度的增大,m/z 88的信号强度呈现先增大后减小的趋势,离子传输管温度在300℃时达到最大。本研究中离子传输管温度采用300℃。

    3.2 烟草叶片的ND-EESI-MS指纹图谱分析

    在优化实验条件下,采用ND-EESI-MS直接检测烟草叶片样品,获取了实验对照组和水涝胁迫1、3、5和7 d下烟草样品的指纹图谱信息。每个样品仅用1 min即可获得如图4所示的一级指纹图谱,可以实现高通量快速检测。实验对照组和水涝胁迫组5组烟草样品的一级指纹图谱上基本是以m/z 163作为基峰,且都有明显的m/z 106、132和163等离子峰,但在不同处理下的一级质谱图中各质荷比的丰度存在差异,实验对照组中m/z 200~400离子峰数目明显比胁迫处理组多,m/z 132随着胁迫时间增加而呈现下降趋势,m/z 180和211在胁迫后期才出现。

    选择m/z 106为母离子进行二级串联质谱分析,如图5A所示。母离子m/z 106(C3H7NO3)失去质量数为18(H2O)的碎片,产生m/z 88的主要碎片离子,并且这也与丝氨酸标准品的二级碎片行为一致,因此最终将m/z 106归属为丝氨酸。选择一级指纹图谱中丰度高的m/z 163(C10H14N2)进行二级串联质谱分析,如图5B所示。母离子m/z 136失去质量数为31(CH5N)的碎片产生特征碎片离子m/z 132,以及丢失C3H7N得到特征碎片离子m/z 106,这与烟碱标准品的二级碎片行为一致,因此最终确定m/z 163为烟碱。

    3.3 ND-EESI-MS鉴定烟草中的代谢产物

    采用ND-EESI-MSn方法,共鉴定出水涝胁迫下烟草中22种代谢产物,其中包含丝氨酸、脯氨酸、谷氨酸、丙氨酰甘氨酸、亮氨酸、天冬酰胺和组氨酸7种氨基酸,儿茶酚、麦芽酚、咖啡酸、阿魏酸、肉桂酸、白藜芦醇、山柰酚、槲皮素和绿原酸9种酚类物质,烟碱和降烟碱2种生物碱,苯乙醛和柠檬醛2种醛类物质,以及苹果酸和β-大马烯酮。表1中列举了各化合物名称、分子式、母离子([M+H\]+)以及二级碎片离子(m/z)。

    3.4 水涝胁迫下烟草中代谢产物相对含量的热图分析

    以烟草中代谢物的指纹图谱信号强度对代谢物含量进行相对定量,图6为利用ND-EESI-MS技术检测得到的化合物相对含量变化热图,从图6中可直观看出不同水涝时间胁迫下烟草代谢物相对含量变化情况。烟草在应对水涝胁迫时,随着胁迫时间的延长,烟草中儿茶酚、咖啡酸、阿魏酸、绿原酸、麦芽酚、谷氨酸、脯氨酸、天冬酰胺、组氨酸、丙氨酰甘氨酸、苯乙醛、烟碱、降烟碱等物质相对含量呈现上升趋势,肉桂酸和亮氨酸含量呈现下降趋势,山奈酚、白藜芦醇、槲皮素、丝氨酸、苹果酸、柠檬醛、β-大马烯酮等物质含量呈现先上升后下降趋势。

    氨基酸作为植物体中重要的氮代谢物,对植株的氮代谢及压力胁迫下植株的抗性都具有重要的作用[23]。脯氨酸在许多植物中是一种优质的渗透压调节剂,烟草在应对水涝胁迫时,随着水涝胁迫时间的延长,脯氨酸含量上升。谷氨酸、丝氨酸、组氨酸等氨基酸参与了植物体内γ-氨基丁酸(GABA)的合成[24],其含量也都呈现上升趋势。莽草酸-苯丙素途径与植物逆境胁迫密切相关[25],参与其途径的绿原酸含量呈现上升趋势,其下游的阿魏酸和咖啡酸含量整体也呈现上升趋势以响应水涝胁迫,而儿茶酚、槲皮素、白藜芦醇、山奈酚、苹果酸等多酚类化合物含量都有所增加,烟草中重要的烟碱、降烟碱等物质也都呈现上升趋势。在应对水涝胁迫过程中,烟草产生相应的应激反应,其代谢物含量也会相应地升高或降低,激发一系列代谢物合成,以帮助烟草修复损伤或达到新的代谢平衡。

    4 结 论

    采用ND-EESI-MS技术,选用烟草中常见的丝氨酸作为优化离子,对萃取剂种类、萃取剂流速、电喷雾电压、样品端辅助气压、雾化气压和离子傳输管温度等实验仪器参数进行了优化。 在优化条件下,无需样品复杂预处理, 直接检测到水涝胁迫下烟草中22种代谢产物,单个样品的测定时间不超过1 min。在应对水涝胁迫时,烟草中脯氨酸、谷氨酸、丝氨酸、组氨酸等初生代谢产物与渗透调节和GABA合成相关,其含量都有所增加,绿原酸、阿魏酸和咖啡酸等参与植物体内莽草酸-苯丙素途径,其含量也都有所增加,儿茶酚、苯乙醛、烟碱和降烟碱等次生代谢产物含量也呈现上升趋势以响应水涝胁迫。本研究结果从代谢组学层面上揭示了水涝胁迫下烟草代谢产物的变化,为进一步了解烟草响应水涝胁迫提供了理论基础。本研究建立了一种绿色、原位、快速分析烟草中代谢产物的技术,为研究植物代谢组学提供了参考。

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    Abstract Tobacco (Nicotiana tabacum L.) is a model plant for plant science research and one of the important economic crops, and waterlogging stress is one of the most important factors affecting the quality and yield of Nicotiana tabacum. In this study, the instrument parameters such as the type of extractant, the flow rate of extractant reagent, the electrospray voltage, the pressure of sample auxiliary, the pressure of extractant reagent and the temperature of ion transfer tube were optimized by serine, which was common in Nicotiana tabacum as an optimized ion. A total of 22 metabolites of Nicotiana tabacum were obtained under waterlogging stress by neutral desorption-extractive electrospray ionization mass spectrometry (ND-EESI-MS) without any sample pretreatment, including serine, proline, glutamic, D,L-alanyl-glycine, leucine, asparagine, histidine, catechol, maltol, cinnamic acid, caffeic acid, ferulic acid, resveratrol, kaempferol, quercetin chlorogenic acid, nicotine, nornicotine, phenylacetaldehyde, citral, malic acid adn β-damascenone. In response to waterlogged stress, the contents of proline, glutamic acid, serine, histidine about primary metabolites in Nicotiana tabacum were increased, and the contents of secondary metabolites such as chlorogenic acid, ferulic acid, caffeic acid, catechol, phenylacetaldehyde, nicotine and nornicotine were also increased. The results exhibited the metabolites changes of Nicotiana tabacum under waterlogging stress, and thus provided a theoretical basis for further understanding the response to waterlogging stress in Nicotiana tabacum. Accordingly, the application of ND-EESI-MS in plant in-situ detection had many advantages such as high sensitivity, wide detection range, high throughput and rapid detection (less than 1 minute for detection of a single sample). Also it provided a new plant metabolomics technique for enriching the metabolic mechanism of Nicotiana tabacum in response to waterlogging stress.

    Keywords Neutral desorption-extractive electrospray ionization mass spectrometry; Nicotiana tabacum L; Waterlogging stress; Metabolomics