文物中常用蛋白质类胶结材料的热裂解-气相色谱/质谱识别
王娜 谷岸 闵俊嵘 李广华 雷勇
摘 要 热裂解-气相色谱/质谱（Py-GC/MS）技术具有灵敏度高、适用范围广等特点，广泛应用于文物中天然有机材料的定性分析，但其在天然蛋白质材料种类识别方面尚缺乏系统研究。本研究以中国古代彩绘、建筑、家具等文化遗产中常用的猪血、动物胶、鸡蛋等蛋白质类胶结材料为研究对象，系统分析并总结各类材料Py-GC/MS特征识别组分。研究表明，猪血、动物胶、蛋清不含氮裂解产物中，部分组分可作为辨别这三类材料的特征组分，其含氮裂解产物主要可分为吡咯、腈、脯氨及吲哚类组分，不同材料中这四类组分相对含量分布特征差异明显，可以此实现猪血、动物胶、蛋清的辨别;此外，蛋黄的裂解产物主要是脂肪酸。通过所建立的方法及总结的数据，推断故宫旧藏填漆夔龙纹长方桌表层灰胎所用胶料含有猪血，而故宫养心殿西围房外檐沥粉贴金彩画所用沥粉中含有动物胶。本方法易于推广，适用于我国文物中各类蛋白质材料的快速、准确识别，对文物中其它有机材料的研究也具有借鉴意义。
关键词 热裂解-气相色谱/质谱; 文物胶结材料; 蛋白质; 猪血; 动物胶; 鸡蛋
1 引 言
材质的识别是文物研究及修护工作的基础。我国文物常用的蛋白质、油脂、多糖、树脂、蜡等有机材料多为天然高分子材料，组分复杂，其定性识别一直是文物保护面临的难题。目前，文物中天然有机材料的识别主要是采用红外光谱（FTIR）[1]、气相色谱/质谱（GC/MS）[2]、液相色谱（LC）[3]等技术，此外，拉曼光谱（RS）[4]、免疫荧光法[5]等技术也可用于部分材料的检测。其中，FTIR、RS等光谱分析方法操作简单，但在实际样品检测中易受杂质干扰，且通过这些技术仅可大致判定有机材料的属类，而无法实现其具体种类的辨别; 免疫荧光法检测蛋白类材料易受样品背景干扰而出现假阳性结果; GC/MS、LC技术可对高分子材料水解释放出的单体进行定性及定量分析，并通过对比标样信息确定材料种类，是目前文物中有机高分子材料分析最常用的方法，但是GC/MS、LC实验需对样品进行水解、衍生化等前处理，过程繁复， 耗时长，且处理过程会造成样品流失。
我国漆器文物的主要原材料中国大漆，固化后理化性能优良，目前还没有溶剂能将漆膜水解，因此，GC/MS、LC等技术无法直接应用于漆膜的分析，为此，研究者将热裂解-气相色谱/质谱联用（Py-GC/MS）技术应用于漆器文物的研究[6]。在GC/MS基础上发展起来的Py-GC/MS技术，其工作原理是先将高分子样品在惰性气体保护下高温裂解气化，裂解产物随即进入GC/MS系统被充分分离并识别，最后根据裂解产物的信息还原样品分子结构及组成信息。Py-GC/MS兼具GC/MS高灵敏度的特点，能分析微量样品，而且无需样品前处理，待测样品可直接进样分析，这样不仅可以简化实验流程，而且能保证样品中所有有机组分都进入分析系统，避免了样品处理过程中待测组分的流失，可同时实现多种材料的识别[7，8]，因此非常适用于文物样品复杂体系中天然有机高分子材料的综合分析檢测。目前，已有多个研究组基于Py-GC/MS技术进行文物有机材料成分的识别以及材料性能的研究[9～11]。
高分子材料高温裂解产物不同于其构成单体，因此，每种材料的Py-GC/MS识别都基于对其标样的充分研究。动物胶等天然蛋白质是在东西方文物中均被广泛应用的胶结材料，目前Py-GC/MS技术在文物中蛋白质类材料研究方面的应用虽已有报道[12～14]，但Py-GC/MS实验数据解析复杂，现有研究中所报道的蛋白质特征裂解组分并不一致，如Fabbri等[12]在蛋白质裂解产物中检测到2，5-二酮哌嗪;? Wei等[13]以吡咯、六氢吡咯-[1，2-a＼]-吡嗪-1，4-二酮、甲苯、异吲哚、3-甲基-1H-吡咯作为蛋白质存在的依据; Orsini等[14]则提出由于不同蛋白质氨基酸序列不同，干酪素、蛋清、动物胶等西方艺术品中常用蛋白质材料的热裂解谱图在分子水平上有区别。目前，有关中国文物中常用蛋白质类材料的裂解产物的系统分析尚未见报道，因而现有研究成果难以直接应用于我国文物中蛋白质胶结材料的辨别。
我国古代彩绘、建筑、家具等文物中常用的蛋白质胶料主要是动物血料和动物胶。通过动物血制成的血料，是中国传统古建油灰地仗中的必需胶料，最常用的是猪血，牛羊血等经加工也可制成血料，但黏性较差; 动物胶则是从胶原蛋白中提炼出来的浅黄色、透明、无味胶质，通常取自鱼、牛、驴、猪等动物的皮、骨骼或结缔组织，常用作彩绘颜料胶结材料、家具或建筑部件粘接材料[15]; 此外，鸡蛋也可被用作中国古代建筑彩画的胶料[16，17]。
为快速、准确判断文物中常用蛋白质类胶结材料的类别，本研究以动物胶、猪血、蛋清、蛋黄等材料为研究对象，建立了Py-GC/MS分析方法，总结各类材料的Py-GC/MS特征识别组分，以期实现动物胶、动物血料、鸡蛋等蛋白质材料的Py-GC/MS辨别。天然蛋白质材料的主要组分除氨基酸外，还含有十六酸、十八酸等脂肪酸[18]，氨基酸及脂肪酸均为极性组分，其分子结构中含有的羧基、羟基等极性基团，会导致裂解组分挥发性低且与色谱柱固定相间相互作用较强，会延迟裂解组分的保留时间，而且会造成色谱峰拖尾，因此本研究采取在线甲基化技术，以四甲基氢氧化铵（TMAH）为甲基化试剂，在样品裂解的同时发生甲基化反应，进而获得裂解组分的甲基化产物，以增强其挥发性和色谱分辨率[19]。将所建立的分析方法及总结的特征裂解产物信息用于故宫旧藏填漆夔龙纹长方桌表层灰胎样品、故宫养心殿西围房外檐沥粉贴金彩画沥粉样品中蛋白质类胶料的分析，以验证所建立方法的可行性。
2 实验部分
2.1 实验材料
猪血、动物胶由故宫博物院文保科技部修复科组提供，鸡蛋购于本地市场。用平头画笔将猪血、蛋清、蛋黄分别均匀刷涂于玻璃板上，放置在室温条件下，干燥至恒重后即可进行分析。动物胶直接取样测试。
衍生化试剂10%四甲基氢氧化铵（TMAH）甲醇溶液（分析纯）购于阿拉丁试剂公司。
2.2 仪器与分析参数
采用日本Frontier公司EGA-PY3030D型热裂解仪，结合美国Agilent公司7890B/5977A气相色谱/质谱联用仪，色谱柱为HP-5MS毛细管色谱柱（30 m×0.25 mm×0.25μm），四极杆质谱仪，电子轰击源，电离源能量70 eV。采取在线衍生化技术，将约1 mg样品与5 μL 10% TMAH甲醇溶液放入不锈钢样品舟，然后直接送入热裂解仪石英裂解管，样品衍生化反应可在裂解反应进行的同时完成。裂解温度500℃，裂解时间12 s。热裂解仪与气相色谱接口温度300℃。色谱分析采用分流进样，分流比50∶1，载气为氦气，流速1.0 mL/min。GC进样口温度300℃; 色谱柱初始温度50℃，保持2 min，柱温以4℃/min从50℃升到300℃，保持15.5 min。质谱离子源温度230℃，四极杆温度150℃，采取全扫描模式，扫描范围为m/z 29～550，质谱识别数据库NIST libraries。
为保证实验结果的准确性，参比样品在相同条件下均重复进行3次Py-GC/MS测试，取其平均值作为最终结果。
2.3 文物样品信息
为评价所建立蛋白质材料分析方法及结果的有效性，对两个清代文物样品进行分析研究。1号样品采自故宫旧藏填漆夔龙纹长方桌，方桌边角处有残损，肉眼可见两层灰胎，实验样品为表层灰胎，填漆夔龙纹长方桌及灰胎样品取样位置见电子版文后支持信息图S1-a。2号样品采自故宫养心殿西围房外檐彩画沥粉贴金区域，实验样品为沥粉，具体取样位置见电子版文后支持信息图S1-b。
3 结果与讨论
3.1 蛋白质胶结材料Py-GC/MS分析条件优化
裂解温度、裂解器工作原理、GC/MS工作参数，以及衍生化试剂的选择，都会影响有机材料Py-GC/MS分析结果[20]。本研究所用热裂解仪为微型炉裂解器，衍生化试剂TMAH是Py-GC/MS分析常用的甲基化试剂[19]，此外，本研究通过减缓柱温箱升温速率、延长色谱运行时间、扩大质谱检测范围，建立了一套能满足于不同天然有机材料分离与检测的GC/MS分析程序，以适应复杂文物样品的检测需求。在此基础上，首先以动物胶为分析对象，对比其在不同裂解温度下所得裂解产物，以确定蛋白质材料的适宜裂解温度。
分别在400℃、500℃、600℃裂解动物胶，实验结果如图1所示。经谱图解析，发现动物胶在不同温度下所获得的裂解产物基本一致，但在400℃检测到的特征裂解产物相对强度低，表明动物胶裂解不完全; 在600℃检测到大量小分子裂解产物，且色谱峰重叠最明显，表明动物胶裂解程度过高; 在500℃检测到多种特征裂解产物，且各组分间色谱分辨率较高。因此，本研究选取500℃为蛋白质材料裂解温度。
3.2 蛋白质胶结材料Py-GC/MS分析
用所建立Py-GC/MS方法分别分析猪血、动物胶、蛋清、蛋黄参比样品，以确定各类材料的特征裂解产物。对比参比样品分析结果，发现蛋黄裂解产物与动物胶、猪血、蛋清差异很大，因此首先總结并比较猪血、动物胶、蛋清的Py-GC/MS特征识别信息，再单独总结蛋黄的特征识别信息。
3.2.1 猪血、动物胶和蛋清Py-GC/MS分析及辨别 图2为猪血、动物胶和蛋清的Py-GC/MS分析谱图。综合考虑色谱峰强度及NIST数据库识别结果，三类材料裂解产物中与数据库比对结果匹配度高，以及色谱峰强度高的裂解产物均列于电子版文后支持信息表S1。由于采取了在线甲基化技术，含羧基、羟基的裂解组分，质谱所识别到的是其甲基化产物。
根据电子版文后支持信息表S1，可将参比样品热裂解产物分为3类，即含氮组分、不含氮组分以及保留时间在53～63 min的胆固醇类组分。胆固醇类组分在猪血及动物胶中检出，在蛋清中未检出。为了对比各类裂解产物在3类蛋白质中的分布情况，将各类裂解产物（除胆固醇类组分）在猪血、动物胶、蛋清中的色谱峰面积进行归一化处理，其在参比样品中的相对含量见电子版文后支持信息表S1。
分析各类裂解产物的相对含量，发现包括甲苯（No.2）、苯乙烯（No.8）、十六酸（No.56）、十八酸（No.59）等在内的15种不含氮组分（在表S1中为粗斜体且加下划线标注），在猪血、动物胶、蛋清中的总含量差异较大。图3为参比样品裂解产物中不含氮组分与含氮组分的含量分布，可见猪血中不含氮组分的含量最高（42.4%），而动物胶、蛋清中含量较低（34%和27.2%）。
虽然不含氮组分在3种参比样品中的含量均不低，且与含氮组分的含量比可作为判别不同蛋白质的参考数据之一，但此类组分不建议作为蛋白质类材料的特征识别产物，因为文物中常出现各种有机材料混合使用的情况，如清代古建油灰地仗中同时用到猪血、桐油和面粉[21]，而本研究所检测到的甲苯等不含氮组分在其它天然有机材料（如大漆中）可检测到[11]，十六酸、十八酸则几乎在各类天然材料（如油脂、多糖、树脂、蜂蜡）中均存在[18]，因而此类组分只能作为蛋白质类材料识别的参考组分。但需要指出的是，猪血裂解产物中的5-甲基-2-（1-甲基乙基）-环己醇（No.25）、动物胶裂解产物中的环十二烷（No.48），虽然不是含氮组分，但这两类物质仅在特定蛋白质中被检出，且含量很高，因此可作为猪血与动物胶Py-GC/MS分析的特征识别组分。
蛋白质主要构成组分是氨基酸，与文物中常用的油脂、多糖、树脂、蜡等天然材料不同的是，其组成元素除碳、氢、氧外，还含有氮元素，因此电子版文后支持信息表S1中所列猪血、动物胶、蛋清参比样品裂解产物中的含氮组分，均可作为相应蛋白质材料的特征识别组分。其中，吡咯（No.1）、1-甲基-2，5-吡咯烷二酮（No.20）、2-吡咯甲酸甲酯（No.21）、3，5，5-三甲基-2，4-咪唑烷二酮（No.27）、1-甲基-1H-吲哚（No.31）、2-甲基-5-氧代-L-脯氨酸甲酯（No.46）、吡哌咯生（No.47）、六氢-3-（2-甲基丙基）-吡咯并[1，2-a＼]吡嗪-1，5-二酮（No.58）在三类材料中均检出，且相对含量较高，实际文物分析过程中，这些组分的检出可初步判定样品中存在蛋白质类材料。
为进一步实现猪血、动物胶、蛋清的辨别，对电子版文后支持信息表S1所列含氮裂解组分进行了分析计算，发现吡咯类（Nos.1、3、5、9，、10、20、21、38、54、57、58、60、61）、腈类（Nos.4、11、17、24、29、36、42）、脯氨类（Nos.28、40、43、46、49、50）及吲哚类（Nos.31、33、39、41）等裂解产物的含量，在猪血、动物胶、蛋清含氮裂解组分总量中的占比高达72.9%、67.6%及65.3%，因此，可通过这四类组分在不同蛋白质中的识别情况辨别不同种类蛋白质材料。
猪血、动物胶、蛋清中吡咯类、腈类、脯氨类及吲哚类等4类裂解产物在含氮裂解产物中的含量分布如图4所示，不同蛋白质材料中，这4类组分的分布差异明显。其中，猪血含氮裂解产物中吡咯类、腈类、吲哚类组分的含量均约为20%，吲哚类含量最高（26.2%），而脯氨类组分的含量<5%; 动物胶中吡咯类组分的含量高达52.1%，脯氨类组分的含量为10.2%，而腈类、吲哚类组分的含量<4%; 相较于猪血和动物胶，蛋清中4类组分的含量分布差异最小，其中，吡咯类组分的含量最高（23.1%），而其它3类组分的含量均在13%～15%之间。
3.2.2 蛋黄Py-GC/MS分析 蛋黄参比样品Py-GC/MS分析谱图见图5，主要裂解产物识别结果及其相对含量见表S2。经计算，蛋黄裂解产物主要包括2.3%甘油、0.6%磷酸、47%不饱和脂肪酸、0.9%含氮组分、45.4%饱和脂肪酸、1%脂肪酸甘油酯，以及2.8%胆固醇及其衍生物类组分，其中甘油、磷酸、不饱和脂肪酸、饱和脂肪酸以及脂肪酸甘油酯来自蛋黄中的油脂、磷脂等，而含氮组分来自蛋黄中的蛋白质[22]。
与动物胶、猪血、蛋清等材料中检测到大量含氮组分不同，蛋黄裂解产物中超过90%为脂肪酸，且以不饱和脂肪酸居多，在蛋黄裂解产物中含氮组分的含量<1%。此外，蛋黄中检测到的胆固醇及其衍生物类组分与动物胶、猪血中检测到的此类材料一致。因此，動物胶、猪血、鸡蛋中均含有胆固醇类组分，但鸡蛋中的胆固醇类组分仅存在于蛋黄中。
3.3 文物样品分析
将所建立的蛋白质类胶结材料Py-GC/MS分析方法，及所总结的裂解产物信息用于故宫旧藏填漆夔龙纹长方桌表层灰胎、故宫养心殿西围房外檐沥粉贴金彩画沥粉样品的分析，以评价方法的可行性。
由于文物样品中矿物颜料等无机材料，以及其它有机材料可能会干扰蛋白质裂解产物的识别，对于文物样品Py-GC/MS实验结果，仔细分析了其谱图中所有色谱峰的质谱图，而不仅限于强度高的峰。为确保分析结果的准确性，只有当色谱峰的保留时间与质谱数据均能与参比样品相对应，才认定此物质属于蛋白质裂解产物。两个文物样品Py-GC/MS分析结果见图6和图7，经质谱解析，在两个样品中均识别出部分蛋白质裂解产物，具体结果见电子版文后支持信息表S1，图6和图7中色谱峰编号与表S1中编号相对应。
除电子版文后支持信息表S1所列裂解产物外，在两个文物样品中还检测到其它含氮组分。在长方桌表层灰胎样品中检测到1，3-二甲基-3，4，5，6-四氢-2（1H）-嘧啶酮（No.A，相对含量6.0%）、5-甲氧基-2-甲基-1H-吲哚（No.B，相对含量1.9%）、3-哌啶基-1，2-丙二醇（No.C，相对含量16.1%），在沥粉样品中检测到1-甲基-吡咯烷-2-酸（No.D，相对含量4.6%）、1-甲基-氢尿嘧啶（No.E，相对含量2.2%）、1，3，5-三甲基l-2，4（1H，3H）-嘧啶二酮（No.F，相对含量0.9%），以及N-甲酯基-d-脯氨酸甲酯（No.G，相对含量0.4%），这些组分的检出应该与蛋白质材料的老化以及样品中其它无机、有机组分的影响有关。
文物样品中吡咯类、腈类、脯氨类及吲哚类裂解产物在含氮裂解产物中的含量分布见图8。长方桌灰胎样品中吡咯等四类裂解产物的分布情况与蛋清最接近（见图4），但考虑到样品中吲哚类裂解产物相对含量（10.7%）高于腈类（5.8%）及脯氨类（5.7%），与猪血情况类似，而且在样品中检测到蛋清所不含的胆固醇类组分，因此，推测填漆夔龙纹长方桌表层灰胎所用胶结材料含有猪血。据报道，猪血料不但具有粘接力，而且还有耐水、耐油、耐酸碱等特点，因此在传统古建地仗或者器物灰胎制作中被广泛使用[21]。
养心殿西围房外檐沥粉贴金彩画所用沥粉中吡咯等4类裂解产物的分布情况与动物胶（图4）基本一致，而且在此样品中检测到大量环十二烷（No.48），是动物胶的特征不含氮裂解产物（见电子版文后支持信息表S1），因此推断燕喜堂彩画沥粉贴金彩画所用沥粉中的胶结材料为动物胶。沥粉贴金是用装有沥粉，即胶和土粉混合成的膏状物的尖端有孔的管子，按彩画图案描出隆起的花纹，上面涂胶后再贴金箔，以求图案有立体感。沥粉贴金工艺最早出现在唐代，是我国传统壁画绘制和建筑装饰中特有的、装饰效果显著的制作工艺[23]。目前已发表研究成果中鲜见对沥粉所用胶料的研究，但有关沥粉工具与材料的记载中，提到沥粉多用动物胶，如骨胶、牛皮胶等作为胶料[24，25]。
4 结 论
Py-GC/MS技术越来越广泛应用于文物中有机材料的定性分析。基于所建立的Py-GC/MS分析方法，本研究系统分析了中国古代彩绘、建筑、家具等文化遗产中常用的猪血、动物胶、鸡蛋等蛋白质类胶结材料，并总结其特征Py-GC/MS识别信息。研究所建立Py-GC/MS实验方法易于推广，研究成果对于不同测试条件下蛋白质材料Py-GC/MS分析结果的解析具有重要参考价值。
故宫旧藏填漆夔龙纹长方桌表层灰胎所用猪血、养心殿西围房外檐沥粉贴金彩画沥粉所用动物胶的识别，验证了所建立方法的可行性，但由于文物样品经过长时间的自然风化，且样品本身物质构成复杂，都会影响蛋白质材料的检测。因此， 蛋白质材料的老化，以及文物中其它无机、有机材料对蛋白质检测的影响均有待进一步研究。
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Abstract Pyrolysis-gas chromatography/mass spectrometry （Py-GC/MS） has been more and more used in the qualitative investigation of organic materials in cultural relics， owing to its high sensitivity and wide range of application. However， there are few systematical studies on identifying species of different protein materials by Py-GC/MS. Therefore， porcine blood， animal glue and egg， which are all commonly used as binding media in ancient Chinese artworks and objects， such as polychrome， architecture and furniture， have been investigated in the present work by Py-GC/MS， and the characteristic components of each protein have been summarized. Based on the established Py-GC/MS procedure， it's found that some nitrogen-free pyrolysis products can be served as characteristic components for distinguishing porcine blood， animal glue and egg white. Nitrogen-contained pyrolysis products of porcine blood， animal glue and egg white can be mainly divided into pyrroles， nitriles， prolines and indoles， and the relative content of the four classes of products in different protein is distinctly different， so it can also be served as feature information for distinguishing porcine blood， animal glue and egg white. In addition， pyrolysis products of egg yolk are mainly fatty acids. The established Py-GC/MS procedure and summarized data were successfully applied to the identification of protein binding medium in two historical samples of Qin Dynasty， which were collected from the mortar of Polychrome Lacquered Table with “Kui Long” Pattern and the ground layer of gilding painting on the eaves of West Wei-Fang of Hall of Mental Cultivation respectively. Research results of the present work are easy to spread， and its not only suitable for the rapid and accurate identification of different proteins in cultural relics， but also has reference significance in the research of other organic materials used in cultural relics.
Keywords Pyrolysis-gas chromatography/mass spectrometry; Binding medium in cultural relics; Protein; Porcine blood; Animal glue; Egg
