微流控器官芯片的研究进展

    陈超瑜　马妍　方群

    

    

    

    摘 要 器官芯片是利用微流控芯片系统对微流体、细胞及其微环境的灵活操控能力，在微流控芯片上构建以模拟人体组织和器官功能为目标的集成微系统，为药物和疫苗的有效性和生物安全性的评估，以及生物医学研究提供更接近人体真实生理和病理条件的、成本更低的筛选和研究模型。本文从芯片结构和细胞培养的空间构型方面对各种器官芯片系统及其应用进行了分类介绍，包括基于通道、基于培养腔室和基于膜的器官芯片系统，并对器官芯片的最新研究进展进行了评述。

    关键词 器官芯片; 动态培养; 微流控技术; 评述

    1 引 言

    一种新药至少需要经过实验室实验、临床前实验（动物实验）、临床试验（一/二/三期）等过程，才能申请上市，进入市场后还需要进行四期临床试验和上市后再审批等环节，其平均研发周期12～15年，费用约为10亿美元。但是，约92%经过临床前实验（动物实验）验证有效的药物，在进入临床试验后却失败了，这导致新药研发面临着投入大、风险高、成功率低、产出低的局面。人类健康和生物产业发展的迫切需求催生了仿生器官芯片（Organ on a chip）的发展[1]。器官芯片是利用微流控芯片系统对微流体、细胞及其微环境的灵活操控能力，在微流控芯片上构建以模拟人体组织和器官功能为目标的集成微系统，为药物和疫苗的有效性和生物安全性的评估以及生物医学研究提供更接近人体真实生理和病理条件的、成本更低的筛选和研究模型。目前，文献报道了多种不同类型的器官芯片系统， 不仅能够在芯片上进行多种器官细胞（组织）的共培养和相互作用研究，还可对应体内生理状态[2]，构建能模拟流体剪切力[3]、动态机械应力[4]、浓度梯度[5]等条件的微环境[6，7]。目前，器官芯片系統已用于药物筛选、药物毒理学研究、肿瘤转移研究、体内微环境模拟等方面[8，9]，有望为药物研发过程中动物实验和早期临床试验提供一种低成本的替代品[10～13]。与实验室实验和临床前实验相比，器官芯片系统可模拟较为复杂的体内环境，包括细胞与细胞之间的作用、组织与组织之间的作用、细胞/组织与血液之间的作用，同时，还为时间和空间上观察不同细胞的生长状况，进行多种刺激实验，并检测相应的各项指标提供了可能[14，15]。

    为构建具备完整的器官功能的芯片， 需不断地对芯片进行改进和优化。目前，文献报道的器官芯片多可在一定程度上模拟部分器官的特定功能，主要分为单器官芯片和多器官芯片。根据模拟的器官种类的不同，单器官芯片可分为肺芯片[16]、肠芯片[17]、肾芯片[18，19]、脑芯片[20]、心芯片[21]等。多器官芯片主要包括肠-肾芯片[22]、肝-肠芯片[23]、肠-肝-肿瘤芯片[24]等。单器官芯片常用于模拟对应器官的功能和构建疾病模型。多器官芯片常用于模拟药物在人体中的吸收（Adsorption）、分布（Distribution）、代谢（Metabolism）和消除（Elimination）过程，以构建ADME模型和其它疾病模型[25]。在此基础上，还提出了仿生人体芯片（Human on a chip）的概念[7，8，14，15]。相较于二维（Two-dimension， 2D）单一细胞静态培养的药物刺激结果，器官芯片上采用多维细胞培养和多细胞共培养模式，并配合细胞外微环境的模拟，在其上进行的药物刺激实验，结果更接近人体各组织、各器官协同后的药物作用情况[26]。

    现有综述多从芯片材料特性[2]、模拟微环境的特点[4，6，8，9]以及芯片应用[3，10～12，14]等方面对器官芯片系统进行介绍，此外，还有一些文献侧重于介绍器官芯片系统发展过程中的问题和挑战，以及未来的发展方向[7，13，15]。本文主要从芯片结构和细胞生长的空间构型对器官芯片进行分类介绍，并介绍了这些器官芯片采用的流体驱动方式，包括重力[27]、蠕动泵[28]、注射泵[29]、气泵[30]和微泵[31]等驱动方式。

    2 器官芯片系统

    利用微流控系统具有的超微量、高通量、高度集成的特点，研究者可将多种器官细胞或组织培养在芯片上的不同位置，彼此之间借助微通道或微结构相互联系，模拟人体内不同器官之间的相对位置和相互作用[15，17，22～25]。超微量和高通量的优点使得研究者可同时进行数个，甚至数十个、数百个平行实验，严格控制相同的实验条件，探究不同的药物浓度、作用时间、药物组合对疾病的治疗效果[30，32，33]。与静态培养相比，动态培养则可为细胞的生长提供更复杂的环境因素，如流体剪切力、机械应力、生化浓度梯度等理化刺激，模拟体内的微环境体系[34]。在流体环境下，细胞会在环境刺激中发生自组装，能更真实地展现其生理功能，比如对于肾的重吸收功能，流体剪切必不可少[35]。动态的机械应力（如血压、肺部压力、骨骼压力等）对于维持机体的生理功能（如细胞的分化、组织形成、肿瘤的形成等）具有重要作用[36]。而对各种生化关键物质浓度梯度的形成和调控，在细胞分化、迁移、免疫反应、癌症的转移等生理过程中具有关键作用[37]。

    依据不同的芯片结构和细胞生长环境的空间构型，可将器官芯片分为基于通道、培养腔室和膜的三类系统。不同类别的器官芯片又可结合不同的驱动方式，如重力驱动、蠕动泵驱动、注射泵驱动、气泵驱动、微泵驱动等，以实现对体内微环境的动态模拟。

    2.1 基于通道的器官芯片

    基于通道的芯片构型具有结构简单、易于加工和尺寸范围广的特点[38～40]，并且便于在其中产生浓度梯度和剪切应力作用[41]，是一种在构建器官芯片时被广泛采用的结构。常见的基于通道的器官芯片由若干个主通道（通道宽度为102～103 μm）和多个连接通道（通道宽度为数微米至数十微米）组成[42]，主通道可用于2D细胞培养和三维（Three-dimension， 3D）细胞培养[43]、细胞单独培养和细胞共培养，主通道之间通过连接通道连通，连接通道用于进行物质的传输和细胞的迁移。基于通道的器官芯片通常用于研究细胞与细胞之间的相互作用[44～47]和化学物质对细胞的作用[48，49]，或用于细胞迁移实验，诱导生成微血管结构[50～52]，还有报道将其应用于构建脑芯片[28]和肾芯片[49]等。

    （A）构建PK-PD模型的器官芯片示意图[53]; （B）模拟药效评估的器官芯片示意图[27]; （C）研究肿瘤转移的器官芯片实物照片[54]; （D）两器官芯片实物照片（D1）和示意图（D2）[31]; （E）四器官芯片示意图[25]

    Fig.2 Organ-on-a-chip systems based on chambers

    （A） Schematic diagram of the organ-on-a-chip system for the PK-PB model[53]; （B） Schematic diagram of the organ-on-a-chip system for evaluating pharmacodynamic[27]; （C） Picture of the organ-on-a-chip system for studying tumor metastasis[54]; （D） Picture （D1） and schematic diagram （D2） of the two-organ-chip （2-OC） system [31]; （E） Schematic diagram of the four-organ-chip （4-OC） system[25]

    2.3 基于膜的器官芯片

    一些高聚物多孔膜具有良好的生物相容性，如聚對苯二甲酸乙二醇酯（Polyethyleneterephthalate， PET）或聚碳酸酯（Polycarbonate， PC）多孔膜，其膜孔孔径在微米级，可阻挡细胞或组织过膜， 或者提高其过膜难度，在许多器官芯片中，多孔膜可作为细胞培养的支撑材料或基底膜，构建独立的培养腔室[21，23，56，57]。多孔膜除了能通过药物及其代谢组分，还能连通和传输不同细胞之间的分泌因子，研究细胞之间的相互作用等。细胞粘附在多孔膜上的培养状态通常是2D的，因此， 基于单层多孔膜的器官芯片一般用于构建肺芯片[16，58～60]、肠芯片[17]、肾芯片[18，61]等，也有在器官芯片两层膜之间进行细胞的3D培养[62， 63]。多孔膜常用于模拟器官的屏障作用，可在基于多孔膜的器官芯片上进行药物刺激和代谢实验[22，59～61，63～66]。

    Huh等[16]设计了一种具备一定仿生功能的肺芯片（图3A），芯片由上下两层PDMS框架和中间PDMS多孔膜组成，在多孔膜上下两侧分别培养上皮细胞和内皮细胞，模拟肺泡结构。芯片两侧通道可连接气泵，通过气泵周期性的工作状态，形成非真空/真空状态的循环切换，产生通道周期性的形变，实现细胞的动态培养。真空状态时，因为PDMS材料具有一定的弹性，中间通道会向两侧扩张，PDMS多孔膜受到拉力变形，粘附在PDMS多孔膜上的细胞也会发生形变，模拟人在吸气时，肺泡扩张导致的肺泡内外壁细胞的受力状态。当两侧通道在还原状态时，PDMS多孔膜回到原始状态，上皮细胞和内皮细胞回复原始状态，模拟人的呼气过程。在此基础上，该研究组进一步构建肺癌模型[60]，进行药物刺激作用实验。基于类似结构的芯片装置，还构建了肠芯片（图3B），研究人体肠道微生物菌群，通过模拟肠道蠕动状态探究组织液流动对肠细胞表型的影响[17]。此外，该研究组在简化芯片结构后，设计了一种肾芯片，在多孔膜上培养原代肾上皮细胞，通过连接注射泵，提供流体剪切应力，模拟体内环境[61]。该研究组还通过连接管连接3个类似“肾芯片”结构的器官芯片，构建了一个神经血管系统（Neurovascular unit， NVU， 图3C）[67]，分为流入式血脑屏障-血管芯片、脑芯片和流出式血脑屏障-血管芯片，用于模拟血管屏障-脑神经、脑、脑神经-血管屏障的结构和功能。NVU系统的共培养形式和芯片的结构具有以下优点：可共培养同一器官中的多种细胞，而不是简单采用1～2种细胞模拟一个器官; 可实现对不同细胞采取不同的流速和培养环境，模拟体内复杂的微环境等。但是，NVU系统也有局限性，由于不同的芯片需要采用连接管进行连接，系统会产生较大的死体积。

    （A）肺芯片示意图，呼气状态（A1）和吸气状态（A2）[16]; （B）肠芯片示意图[17]; （C）神经血管芯片实物照片，芯片结构（C1）和组装结构（C2）[67]; （D）集成式肾小球芯片示意图[18]

    Fig.3 Organ-on-a-chip Systems based on membranes

    （A） Schematic diagram of the lung-on-a-chip system simulating breathing， exhaling （A1） and inhaling （A2）[16]; （B） Schematic diagram of the gut-on-a-chip system [17]; （C） Pictures of the neurovascular unit， structure （C1） and assembly （C2）[67]; （D） Schematic diagram of the integrated glomerulus-on-a-chip system [18]

    Zhou等[18]基于类似的芯片结构发展了一种肾小球芯片（图3D），通过连接注射泵改变通道内流速使多孔膜产生形变，用于模拟人肾小球的部分结构和功能，每个肾小球功能单元由4个基本单元串/并联组成，可模拟肾小球反复分支的毛细血管网络，在体外构建了高血压导致的肾小球终末期肾病。该研究组还提出了一种层压式的器官芯片[63]，可共培养多种器官细胞或组织，在体外构建ADME模型（图4A）。药物从芯片顶部引入，依次经过肠、血管、肝脏、血管、乳腺癌细胞层，最后流入肺、心脏和脂肪组织所在隔层。利用该装置进行了3种药物（环磷酰胺、紫杉醇和5-FU）的药物刺激实验，与96孔板上的实验结果相比，环磷酰胺刺激后装置内的细胞抑制率更高，而其它两种药物刺激后装置内的细胞抑制率更低。这是因为环磷酰胺需要肝脏代谢活化后才能产生抑制肿瘤细胞的作用，而其它两种药物可直接对肿瘤细胞产生作用。

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    Advances in Microfluidic Organ-on-a-Chip Systems

    CHEN Chao-Yu1， MA Yan2， FANG Qun

    1（Institute of Microanalytical Systems， Department of Chemistry， Zhejiang University， Hangzhou 310058， China）

    2（Institute of Cancer and Basic Medicine （ICBM）， Chinese Academy of Sciences;

    Cancer Hospital of the University of Chinese Academy of Sciences; Zhejiang Cancer Hospital， Hangzhou 310022， China）

    Abstract Organ-on-a-chip systems aim to build integrated microsystems to simulate human tissue and organ functions by utilizing the control ability of microfluidic chips to microfluids， cells and their micro-environment， for providing low-cost screening and research models close to in-vivo physiological and pathological conditions for evaluation of effectiveness and biosafety of drugs and vaccines， as well as biomedical research. In this review， the progress of organ-on-a-chip systems based on channels， chambers and membranes are introduced according to their structures and cell culturing modes.

    Keywords Organ-on-a-chip; Dynamic culture; Microfluidics; Review