植入式柔性神经电极在活体脑电信号检测中的研究进展

    王晋芬 田慧慧 方英

    

    

    

    摘?要?植入式神经电极是记录神经电生理信号的一种重要工具,具有单细胞的空间分辨率和亚毫秒级的时间分辨率,在神经科学和神经修复领域具有重要的应用。微纳米加工技术的发展,为植入式神经电极的构建提供了更多的解决方案。基于微纳米加工的植入式刚性电极,由于存在与大脑组织的力学性能不匹配的问题,容易造成大脑组织的免疫反应,影响神经电信号的长期稳定测量。而近年出现的新型植入式柔性神经电极,可与脑组织形成兼容性的界面,引起的免疫反应小,有利于神经电信号的长期稳定测量。此外,植入式柔性神经电极的微型化、高密度和多功能集成也是脑研究新技术的研究热点。本文主要对近年用于活体脑电信号检测的植入式柔性神经电极的相关研究进展进行了评述,包括柔性神经电极结构、电极组织界面、植入方法、微型化方法和集成方法等。

    关键词?柔性神经电极; 植入式神经电极; 免疫反应; 电生理记录; 活体; 评述

    1?引 言

    神经电极作为连接生物信息系统和电子信息系统的接口,是一种记录神经电活动的重要工具。其中,植入式神经电极由于其高的时间分辨率和空间分辨率[1],可对单个神经元的电活动进行记录,在脑环路研究、神经假体研究和脑机接口研究等领域具有重要的应用前景。目前,采用微纳米加工工艺制备的植入式神经电极多是基于硅材料,如记录较深部核团中不同层神经元电活动的密西根电极(Michigan probe)[2,3]和记录大范围皮层脑电信号的犹他电极(Utah electrode)[4,5]。硅基神经电极为刚性电极,其杨氏模量约为100 GPa,而大脑组织的杨氏模量约为10 kPa[6],当刚性电极植入大脑后,由于力学性能不匹配,容易造成大脑组织的损伤,使神经电极无法与脑组织之间形成紧密的界面。另外,由于脑组织的微移动,会造成大脑组织与刚性电极之间产生摩擦,引起大脑的免疫反应[7,8],产生大量的纤维状或细胞状组织,包覆在电极周围,从而阻断神经电极与神经元之间的电信号传输,造成電极失效。

    研究者认识到柔性电子对神经电信号检测的重要性始于20世纪60年代[9],而后,随着基于微纳米加工技术的密歇根电极[10]和尤他电极[11]的出现,柔性神经电极的研究快速发展。柔性神经电极是将神经电子器件制作在柔性或可延展性基板上的电子技术,由于其具有与大脑组织相匹配的力学性能[12],引起的免疫反应小[13],还可与脑组织的曲面结构进行良好的贴附[14,15],由此发展了多种新型的柔性神经电极技术。但是,由于柔性材料的杨氏模量较小,植入过程中容易发生弯曲变形,不易精准植入目标脑区。多种辅助方法,包括可去除的辅助植入物[16,17]、聚合物模板[18,19]等,已被用于提高植入式柔性神经电极的刚性,成功实现了柔性神经电极的精准植入。

    神经环路研究的一个巨大挑战是实现大量神经元活动的同时记录,并达到单个细胞神经活动的高分辨测量。因此,设计和制备具有小尺寸和低创伤的高密度神经电极是一个研究热点[2,20]。另外,神经调制技术的设计更加复杂和精妙,需要将神经电极与光遗传[21,22]、电刺激[23,24]及载药[25]等技术进行集成。本文主要对近年出现的柔性神经电极的结构、植入方法、微型化、高密度及多功能集成等方向的研究进展进行了评述。

    2?新型柔性神经电极结构及植入方法

    2.1?大范围记录的柔性网格神经电极

    柔性网格神经电极(NeuroGrid)是一种基于柔性有机材料基底的神经电极阵列,由于采用网格状结构设计,虽然弹性基底发生弯曲变形,但无机导电材料并不失效,因此具有良好的贴附性和可延展性[15,26]。NeuroGrid采用标准的微纳米加工工艺制备,金属铂或者金作为连接线,聚对二甲苯作为绝缘材料。电极位点的密度与胞体大小和神经元密度相匹配,记录位点的尺寸为10 μm×10 μm,电极之间的间距为30 μm,器件照片见图1A[15]。NeuroGrid的高度可延展性使其能够覆盖小动物的整个背侧皮层或是人脑的多个皮层区域,图1B为NeuroGrid与大脑形成的共形界面[26]。电极位点的表面采用聚苯乙烯磺酸(PSS)掺杂的聚(3,4?乙烯二氧噻吩)(PEDOT)导电聚合物修饰,可大大降低电极与大脑组织之间的阻抗,从而更有效地进行信号传输,NeuroGrid的阻抗分布图和单个电极位点的阻抗图见图1C[26]。上述电极设计为NeuroGrid的高信噪比和稳定信号记录提供了有利的保障,因此,NeuroGrid不用刺入大脑,即可从大脑皮层的表面获取神经元的场电位和动作电位信号。图1D为NeuroGrid记录到的高频神经电信号及分离出的动作电位[15]。 NeuroGrid可记录到典型的中间神经元和锥体神经元的发放,稳定记录到动作电位的时间超过1周。此外,NeuroGrid还可用于外科手术中癫痫病人和语言功能定位任务中的场电位和动作电位监测。图1E和1F为外科手术中,病人保持清醒状态时,执行语言定位任务记录到的场电位信号和频谱图。结果表明,NeuroGrid和常规临床方法均可记录到清醒状态时出现的典型特征峰。NeuroGrid具有以下创新性的特点:不用刺入大脑即可获取稳定场电位和动作电位信号、与大脑共形的结构有利于稳定的电学接触和机械接触、高效的非生物/生物界面有利于信号的高信噪比获取、高的延展性和结构设计的多样性,以及与神经元匹配的电极密度有利于单个神经元动作电位的分离。

    2.2?可注射柔性网格神经电极

    由于柔性神经电极的杨氏模量较小,很难精准植入特定脑区。Liu等[13]采用注射器辅助的外科方法,将柔性网格神经电极精准地植入目标脑区。可注射柔性网格神经电极(Syringe?injectable mesh electronics)的机械性能对于注射过程非常重要,网格需非常柔软,而且应能发生卷曲,组装入直径很小的注射器中[27~30]。网格电极采用SU?8聚合物/金属/SU?8聚合物夹心结构,由呈一定角度的横向和纵向细丝结构组成,如图2A所示[30]。这种结构设计可加速柔性网格神经电极向横向方向弯曲,弯曲后的柔性网格神经电极可成功装入注射器或者玻璃微管(图2B)[13],而后从针管里注入目标位置(见图2C)[29],最后释放出用于电路连接的输入输出端口。其中,2 mm和1.5 cm宽的柔性网格电极可卷曲成95 μm和600 μm的直径。注射至大脑后,柔性网格神经电极的阻抗变化量小于7%,说明柔性网格神经电极具有较好的稳定性,针管注射的方法具有较好的可靠性。可注射柔性网格神经电极可用于海马等脑区的长期场电位和动作电位的测量,实现了对同一神经元8个月的稳定跟踪测量[27]。另外,可注射柔性网格神经电极可扩展至32通道或128通道(图2D)[28],用于高密度神经电信号的获取,实现了神经信号的长期稳定跟踪测量(图2E)[28]。对可注射柔性网格神经电极与大脑组织界面的免疫反应进行了长达一年的研究(图2F)[29,30],共聚焦显微镜的结果显示,柔性网格神经电极与大脑组织界面的星型胶质细胞、小胶质细胞和神经元的分布没有发生明显的改变。此外,通过调控可注射柔性网格神经电极的结构和机械性能,可形成类神经元电子器件,该器件的厚度只有900 nm,与轴突的力学性能匹配[31]。类神经元电子器件可稳定地读取神经活动,而且在植入早期可记录到新的神经元动作电位。免疫染色结果也证实了新神经元的产生,表明类神经元电子器件可能参与了内源性神经干细胞的调制过程,包括吸附和迁移过程。可注射柔性网格神经电极引起的免疫反应小,可与神经组织形成无缝界面,在神经活动记录和神经调制等方面具有较好的应用前景。

    2.3?高密度柔性神经流苏电极

    大脑中的神经元具有尺寸小、密度高、数量大等特点,如大脑皮层中神经元密度约105个/mm3 [32]。 因此,神经电极记录的神经元个数越多,可获取的大脑神经活动越多。基于硅基的植入式神经电极Neuropixels,在一个柄上可集成数百个可寻址的电极位点,实现了多个脑区数百个神经元的电活动记录[2]。而柔性神经电极由于其杨氏模量较小,在植入过程中易发生弯曲变形,很难将多根柔性神经电极同时植入大脑组织,限制了柔性神经电极对神经电信号的高通量记录。本研究组[19]报导了一种柔性神经流苏电极(Neurotassel),可实现柔性神经电极的高密度集成。柔性神经流苏电极采用微纳米工艺制备,由平面?网格?纤维电极三部分组成,过渡的力学结构保证了柔性神经流苏的稳定性。记录位点位于纤维电极结构上,电极的输入和输出端采用聚酰亚胺绝缘的金属连接线导出,而后通过倒装焊的方法与后端电路连接。通过巧妙设计,将神经流苏浸没在熔融的聚乙二醇液体中,在液体表面张力的作用下,柔性神经纤维电极自组装形成针状的高密度神经流苏/聚乙二醇复合细丝,柔性神经流苏的组装图见图3A,组装后的形貌图见图3B。16通道的神经流苏/聚乙二醇复合细丝的直径仅为55 μm,1024通道的神经流苏/聚乙二醇复合细丝的直径约为100 μm(图3C)。其中,1024通道的每个柔性神经纤维电极的截面只有3 μm×1.5 μm, 达到了神经元轴突的尺寸,可极大地降低手术植入过程中电极对脑组织的损伤。聚乙二醇可在脑组织内降解代谢,释放后的超细柔性神经纤维电极能够原位、精准测量清醒大脑内侧前额叶皮层中多个神经元的电活动(图3D)。在小鼠学习嗅觉工作记忆任务(Delayed pair?association task, ?DPA task,)中,神经流苏可稳定跟踪同一神经元的电活动3~6周(图3E),比传统微丝四电极更稳定,能得到更多有关小鼠在学习能力上升过程中神经元发放特性变化的细节信息,有利于研究认知功能过程相关的神经机制。尤其重要的是,免疫分析结果显示,柔性神经流苏电极植入后,对电极周围的神经元损伤小,这是因为柔性神经流苏与脑组织的力学性能相匹配,形成了良好的相容性界面,从而实现了对活体大脑神经元电活动的长期稳定记录(图3F)。此外,柔性神经流苏电极还可与光纤进行集成,用于光遗传和电生理的同步检测(图3G)。目前,柔性神经流苏技术在电极尺寸、集成密度和生物相容性方面的研究进展,将为脑科学和脑疾病研究提供新方法,在脑机接口和神经修复等领域具有较好的应用前景。

    3?超微柔性神经电极

    为了减小植入物对大脑组织的影响,降低植入物的尺寸是一种非常有效的方法。以带状电极为例,其弯曲强度(kB)的定义如下:

    kB=Eswh312(1)

    其中,Es为电极材料的杨氏模量,w为电极的宽度,h为电极的厚度。因此,减小植入器件的尺寸,会降低弯曲强度,使其与大脑更加匹配,并能进一步降低机体的神经胶质反应,减少植入物对大脑微环境的影响。Luan等[16]提出了一种超微的纳米电子神经探针,即纳米电子线(NET,nanoelectronic thread)(图4A)。采用多层光刻工艺制备了两种结构的NET电极(NET?50和NET?10),结构表征图见图4B。NET?50具有8个记录位点,厚度和宽度分别为1和50 μm; NET?10在正反两个表面共分布4个电极位点,电极的横截面积为10 μm×1.5 μm。

    由于较小的尺寸和厚度,NET的弯曲强度降低至1015N m2,可将神经电极与组织之间的界面相互作用力降低至109N量级。

    采用7?μm的碳纤维和20?μm的钨丝可辅助NET植入大脑组织(图4C),植入所引起的创伤小于100 μm(图4D),有利于组织的后期恢复。植入2个月或5个月后,采用双光子对NET电极周围的毛细血管、胶质细胞和神经元变化进行监测,

    发现血脑屏障只受到了较小的影响,而胶质细胞和神经的密度没有明显变化,说明NET电极具有较好的生物相容性,能与神经组织形成稳定的界面(图4E)。将NET电极植入大脑组织考察电极的长期记录性能,在最初的1.5个月,NET的记录性能逐渐趋于稳定,4个月后仍能保持较好的记录性能(图4F)。NET电极长期的稳定性和可靠性,使其在基础神经科学、应用神经科学领域和脑机接口领域具有较好的应用前景。

    4?多功能柔性神经电极

    可控的刺激或抑制是研究行为学和电生理关系的一个有效方法。通过选择性激活或抑制特定的细胞,可加快细胞外复杂的神经网络研究。传统的电刺激方法由于空间分辨率低、非特异的刺激及不稳定的抑制,不能用于细胞的可控刺激。光遗传是一种具有高的时间和空间分辨率的细胞特异性调控方法。对深脑的细胞进行光遗传控制并同时进行电生理记录为神经科学研究提供了一种新手段[33]。Kim等[22]发展了一种与大脑机械性能匹配的超薄多功能光电子系统,该系统可进行脑电信号的无线传输和自由活动小鼠行为的程序控制。微型的有机发光二极管(Inorganic light?emitting diodes,μ?ILEDs))光源结合电子传感器和执行器组成了多功能化光电子系统,该系统包括以下功能部分: 铂电极用于电生理记录和电刺激调控; 微型的光学探测器用于光密度测量; μ?ILEDs阵列用于发射光源; 精密的温度传感器和加热器用于温度控制; 蚕丝蛋白制作的微针用于辅助植入(图5A)。图5B是μ?ILEDs阵列的器件图。

    多功能化光电子系统的厚度为20 μm,表现出低的弯曲强度和高的机械柔韧性(圖5C),可大大降低植入引起的创伤(图5D)。免疫结果进一步表明,μ?ILEDs器件在植入4个月后未引起明显的损伤和胶质疤痕(图5E)。另外,该系统具有优异的光遗传调控和电生理记录功能,为光遗传调控和电生理的同时记录提供了保障(图5F和5G)。最后,将该多功能光电子系统用于小鼠的Y?迷宫行为学实验,发现光遗传调控的小鼠表现出了更强的位置取向性(图5H)。该多功能光电子系统具有高效的光和热调控能力,良好的电生理记录性能。小的机械损伤和免疫反应,在神经基础科学和相关领域具有较好的应用前景。

    5?結论与展望

    近年来,多种新型的植入式柔性神经电极被用于活体脑电信号检测,在柔性神经电极的构建材料、结构设计和制作工艺等方面取得了很多重大进展。新型调控和检测技术的出现及其与柔性神经电极技术的集成,如光遗传技术与柔性神经电极技术的结合,创造了脑功能研究的新机遇。但是,随着神经科学研究的精密化,需要更高的时间和空间分辨率、更长的记录时长和更兼容的电极组织界面。而植入式神经电极只能对检测位点周围50 μm范围内的神经元进行记录,这就需要增加电极的记录位点和密度,减小植入电极的尺寸,提高电极位点的生物相容性。微纳米加工技术为柔性神经电极的发展提供了新的解决方案,此外,信号的低噪声放大、多路复用和无线传输等信号读出技术的发展也将进一步推动植入式柔性神经电极的高密度和高通量集成。

    柔性神经电极为高性能神经假体的发展提供了良好的技术手段,但是,现在用于柔性神经电极的动物模型多为啮齿类动物,较少用于灵长类动物。因此,需要将柔性神经电极技术拓展至灵长类动物的临床研究。灵长类动物的记录和刺激需要将柔性神经电极植入大脑的深部脑区,植入深度将达到几厘米。要达到上述目标,需要融合材料、电子、微加工、力学和神经科学等多学科的研究。另外,柔性电子还需与新的检测方法联用,如光学成像技术、化学传感技术、核磁共振成像技术和纳米技术等,集成的多功能系统将有助于脑电信号的检测和脑功能的研究。

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    Implantable and Flexible Electronics for

    in Vivo Brain Activity Recordings

    WANG Jin?Fen 1,2,5, TIAN Hui?Hui1,2, FANG Ying*1,2,3,4

    1(CAS Center for Excellence in Nanoscience, National Center for Nanoscience and Technology, Beijing 100190, China)

    2(CAS Key Laboratory for Biomedical Effects of Nanomaterials and Nanosafety,

    National Center for Nanoscience and Technology, Beijing 100190, China)

    3(University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China)

    4(CAS Center for Excellence in Brain Science and Intelligence Technology,

    Chinese Academy of Sciences, Shanghai 200031, China)

    5(State Key Laboratories of Transducer Technology, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100190, China)

    Abstract?Implantable electronics are essential for electrophysiological recording at single?neuron and sub?millisecond resolution in the fields of neuroscience and neuroprosthesis. Advances in nano/microfabrication techniques offer new and exciting opportunities for the development of high?density implantable electronics. However, the mechanical mismatch between microfabricated rigid electronics and soft brain tissues has been shown to cause inflammatory responses, leading to signal degradation during chronic recording. Recently, flexible electronics with improved mechanical compatibility to brain tissues have been intensively investigated to improve the performance of chronic neural recordings. Flexible electronics can form conformal interfaces with brain tissue, resulting in minimized inflammatory responses and stable signal recordings. In addition, ultra?small, high?density, and multiple?functionality are also desirable features of flexible neural electronics. In this review, we highlight recent progress in microfabricated flexible electronics for in vivo brain activity recordings, with a focus on structural design, brain/tissue interface, implantation method, minimization and multifunctional integration.

    Keywords?Flexible electronics; Implantable electronics; Immune reactivity; Electrophysiological recording; In vivo; Review