血性胸腹水液基涂片中红细胞去除方法探讨

    李亚辉 代爱军 李会平 张帆

    

    

    【摘要】?目的?探讨去除疑似肿瘤血性胸腹水液基涂片、细胞块中红细胞的方法，为提高临床病理细胞学诊断阳性率提供参考。方法?收集河南科技大学第三附属医院临床送检病理科的新鲜血性疑似肿瘤胸腹水标本65例为研究样本。每例分为对照组与实验组，实验组分别加入95%酒精、85%酒精、75%酒精、50%酒精、30%酒精、10%酒精，与不做任何处理并按照传统方法行液基涂片、细胞块的对照组进行比较。结果?液基细胞学和组织沉渣包埋染色显示，随着酒精浓度的降低红细胞溶解呈上升趋势，当酒精浓度降低到50%以后，红细胞完全溶解，然后随着酒精浓度的进一步降低细胞开始出现退变，切片染色评分有统计学意义（P<0.01）。50%酒精处理组免疫组化阳性信号更强（P<0.05或0.01），肿瘤细胞阳性检出率显著升高（P<0.05或0.01）。结论?50%酒精能去除血性胸腹水液基涂片、细胞块背景中的红细胞，提高肿瘤血性胸腹水细胞学的阳性率。

    【关键词】?血性胸腹水;细胞块;50%酒精;苏木素-伊红染色

    中图分类号：R361+.2?文献标志码：A?DOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2020.12.009

    【Abstract】?Objective?To explore the method of removing red blood cells from liquid-based smear of bloody hydrothorax and ascites and cell blocks of suspected tumors， so as to provide reference for improving the positive rate of clinical pathological cytology diagnosis.Methods?65 cases of fresh bloody hydrothorax and ascites of suspected tumors from the department of pathology of The Third Affiliated Hospital of Henan University of Science and Technology were collected as study samples. Each case was divided into control group and experimental group. The experimental group were added with 95% alcohol， 85% alcohol， 75% alcohol， 50% alcohol， 30% alcohol， 10% alcohol， respectively， and compared with the control group which did not receive any treatment and performed liquid-based smear and cell block according to traditional method.Results?Liquid-based cytology and tissue sediment embedding staining showed that erythrocyte dissolution increased with the decrease of alcohol concentration. When the alcohol concentration dropped to 50%， erythrocyte dissolved completely， and then cells began to degenerate with the further decrease of alcohol concentration， and the section staining score was statistically significant （P < 0.01）. Immunohistochemical positive signal was stronger in the 50% alcohol treatment group（P < 0.05 or P < 0.01）， and the positive detection rate of tumor cells significantly increased （P < 0.05 or P < 0.01）.Conclusion?50% alcohol can remove red blood cells from the background of liquid-based smear of bloody hydrothorax and ascites and cell blocks， and improve the positive rate of cytology in hemothorax and ascites of tumor.

    【Key words】?hemorrhagic pleural and ascites; cell block; 50% alcohol; hematoxylin-eosin staining

    脫落细胞学检查已成为诊断肿瘤的重要方法，其具有快速、准确、方便以及患者痛苦少等优点，已成为临床诊断的重要手段之一[1～2]。但在病理操作中，血性胸腹水由于有大量的红细胞存在，影响了涂片质量的阳性率和诊断结果，给查找肿瘤细胞带来一定困难[3～4]。如何除去血性胸腹水中红细胞，提高胸腹水中肿瘤细胞的阳性率一直是一个亟待解决的问题[5～6]。本实验通过采用梯度酒精处理血性胸腹水，对比液基细胞学涂片、组织沉渣包埋切片、免疫组化在不同浓度酒精条件下的红细胞去除效果和肿瘤细胞阳性检出率。

    1?材料与方法

    1.1?胸腹水标本

    收集2019年1月到12月间送检河南科技大学第三附属医院病理科的疑似肿瘤血性胸腹水标本共65例，均为300 mL。血性胸腹水排除标准：（1）近1～2个月有胸部外伤病史;（2）穿刺时损伤肋间动脉等针刺伤;（3）患有如结核、肺炎、肝硬化、血液系统疾病等对胸水有影响的疾病。血性胸腹水纳入标准：（1）血性;（2）影像学、病理学诊断为肿瘤;（3）有既往肿瘤病史;（4）肿瘤包括肺癌、卵巢癌、前列腺癌、恶性间皮瘤等引起的血性胸水。

    1.2?试剂

    无水乙醇（天津永大）;HE高清恒染试剂（哈尔滨格林）;免疫组化试剂（河南赛诺特生物技术有限公司）;二抗（Dako）;DAB显色剂（Dako）。

    1.3?仪器

    组织脱水机，日本樱花VP1;石蜡切片机，德国LEICA2235;自动染色机，中国达科为;修复仪，丹麦Dako PT LINK;全自动免疫组化染色机，丹麦Dako AS Link 48;细胞学全自动染色机，广州鸿琪。

    1.4?标本分组处理与取材

    将同一血性标本进行等份处理，分为对照组（A组）和实验组（B、C、D、E、F、G组），每组40 mL，将各组新鲜血性胸腹水标本充分摇匀，分别倒入10 mL的塑料离心管，离心5 min，转速2000 r/min[5]，用吸管缓慢吸去上清液，留沉淀物充分震荡后，B、C、D、E、F、G组分别加入95%酒精、85%酒精、75%酒精、50%酒精、30%酒精、10%酒精至10 mL，A组不予任何处理;离心5 min，转速2000 r/min，若沉淀物仍肉眼可见红细胞，重复上述步骤。如果沉淀物含大量血液，则用吸管轻巧吸取上清液与血液之间的“白膜”层沉淀物，放置于另一离心管内，继续上述操作。取七组部分样本分别加入细胞保存液中固定，制备液基涂片;余标本加入95%酒精离心5 min，转速2000 r/min，凝固成细胞块后，放入中性缓冲甲醛中固定，以待制备细胞块。

    1.5?苏木素-伊红（HE）染色检测液基细胞学、细胞块染色情况[7]

    液基细胞学涂片：取各组标记实验标本，并在细胞保存液中固定2 h后，用鸿琪细胞学全自动染色机进行液基细胞学制片，然后在达科为全自动染色机上染色，显微镜下观察，并拍照保存。细胞块切片：取各组标记实验标本，并在10%中性缓冲甲醛液中固定24 h后，在樱花全自动脱水机中处理标本，制备石蜡切片，切片厚度4 μm，常规HE染色，中性树胶封片，显微镜下观察，并拍照保存。

    1.6?用免疫组化染色验证50%酒精处理后对肿瘤细胞的影响[8～9]

    A组、E组分别进行4 μm连续石蜡切片，展片、捞片、烤片1 h后，置于修复仪热孵育升温30 min，维持加热20 min，最高温度97℃，冷却时间40 min，将切片放置自动免疫组化染色机上进行相应指标染色后，放置全自动染色机上脱水透明，中性树胶封片，显微镜下观察，并拍照保存。

    1.7?切片HE染色评分标准

    红细胞评分标准：形态正常（0分）;细胞变形聚集溶解量≤25%（1分）;25%75%（3分）。有核细胞评分标准：细胞退变量>75%（0分）;25%<细胞退变量≤75%（1分）;细胞量≤25%（2分）;细胞正常（3分）。细胞退变是指胞浆红染细胞核膜模糊，有严重核空泡样变，胞浆崩解。退变为百分数统计数十个高倍视野的量。

    1.8?统计学方法

    通过SPSS 23.0软件进行统计学分析，计量资料采用t检验，计数资料采用卡方检验，检验水准：α=0.05，双侧检验。

    2?结?果

    2.1?血性胸腹水HE切片检测结果

    细胞沉渣包埋HE染色结果显示：酒精处理后红细胞开始出现聚集和变形，随着酒精浓度的降低红细胞溶解呈上升趋势，当酒精浓度降低到50%以后，红细胞完全溶解。对照组有核细胞轮廓清楚，染色清晰，随着酒精浓度的降低，当酒精浓度低于50%以后开始出现退变，并且随着酒精浓度的进一步降低，细胞退变逐渐加重。切片染色评分有统计学意义（P<0.01）。见图1。

    液基细胞学HE染色结果显示：当处理液酒精浓度低于85%以后，红细胞出现明显变形，随着酒精浓度降低，红细胞逐渐溶解，在酒精浓度达到50%以后，红细胞完全溶解。随着酒精浓度降低，尤其是酒精浓度低于50%以后，有核细胞开始出现变形，并且细胞退变程度随着酒精浓度的进一步降低而逐渐加重。切片染色评分有统计学意义（P<0.01）。见图2。

    2.2?血性胸腹水免疫组化结果

    与对照组相比，50%酒精组中CK7、EMA、NapsinA、TTF-1免疫组化结果细胞丰富，阳性定位清楚，蛋白表达量显著升高（P<0.05或0.01）。见图3。

    2.3?肿瘤细胞阳性检出率比较

    65例血性胸腹水中，TCT法对照组肿瘤细胞检出率为12.3%（8/65），50%酒精组肿瘤细胞检出率为33.8%（22/65），两种方法HE染色结果差异有统计学意义（P<0.01）。组织沉渣包埋切片中对照组肿瘤细胞检出率为16.9%（11/65），50%酒精组肿瘤细胞检出率为32.3%（21/65），两种方法HE染色结果差异有统计学意义（P<0.05）。见表1。

    3?讨?论

    胸腹腔积液是临床常见症状之一，快速准确地鉴别其性质尤其是寻找到恶性细胞，对疾病的及时诊断和治疗有重要意义[10]。在病理工作中，胸腹水脱落细胞學检查因其具有快速、准确、简便、易行以及患者痛苦少等优点，在临床上得以广泛应用[11～12]。血性胸腹水标本常见于恶性肿瘤等多种疾病，在传统的直接离心涂片法中，因大量红细胞的存在，易造成涂片厚薄不均，影响染色效果，甚至涂片在染色水洗过程中脱片，使观察结果受到限制和影响，干扰诊断的准确性[13]。同时，免疫化学标记鉴别细胞良、恶性时，因红细胞及血浆蛋白增加了着色背景，从而不利于阳性结果的观察。

    本次实验采用酒精梯度处理血性胸腹水，发现当50%酒精处理血性胸腹水时，红细胞完全溶解，同时又能使各种有核细胞完整不变形，核染色质清晰便于观察。50%酒精与胸腹水混合后可以形成低渗溶液，从而使红细胞迅速溶解，同时又不影响有核细胞的形态，利于癌细胞充分暴露避免漏诊。乙醇可以作为固定剂，对癌细胞具有良好的固定作用，保持癌细胞结构完整染色清晰，并可以制成沉渣包埋块，用于特殊染色及免疫组织化学染色[14～15]。此外，TCT法中50%酒精组阳性数较组织沉渣包埋法中50%酒精组多出1例，对该例病人标本进行仔细检查发现，该例TCT玻片上可疑肿瘤细胞量少，仅出现个别散在可疑肿瘤细胞，在沉渣包埋切片中，蜡块粗修时，可能造成可疑肿瘤细胞丢失，因此，沉渣包埋组织切片及染色中，未见肿瘤细胞;对该例沉渣包埋切片做免疫组化验证，结果显示：CK7（+）、EMA（-）、 NapsinA（-） 、TTF-1（-），结合HE切片和免疫组化结果分析支持沉渣包埋切片未见肿瘤细胞的诊断。

    本法的优点是操作简单不用配制任何试剂，直接利用50%酒精低渗原理和短时间（5 min左右）的低速离心使绝大部分红细胞迅速裂解，裂解产物随着上清液而倒掉，而间皮细胞、肿瘤细胞、淋巴细胞等结构完整、不退变，核质分明，核仁清晰，可提高病理细胞学诊断阳性率，值得推广。

    参?考?文?献

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    （收稿日期：2020-08-20?修回日期：2020-10-26）

    （编辑：潘明志）