基于多孔石墨碳柱和正辛烷-异丙醇流动相的高效液相色谱法分离分析食用油中的甘油三酯

    陆湘婷　张世鼎　龚灿　许旭

    

    

    

    摘 要 建立了分离食用油中甘油三酯（TAG）的高效液相色谱分析方法。使用多孔石墨碳柱（Hypercarb柱， 100 mm×2.1 mm， 5 μm），以正辛烷-异丙醇（70∶30，V/V）为流动相，流速0.25 mL/min，在60℃ 柱温下分离，检测波长215 nm。考察了实验条件对分离和检测的影响。在优化条件下，分离了7种植物油和5种动物油中的TAG，借助质谱联用技术，识别了玉米油中14种TAG、橄榄油中9种TAG、葵花籽油中14种TAG、大豆油中14种TAG、芝麻油中15种TAG、花生油中18种TAG、菜籽油中17种TAG、鸡油中16种TAG、猪油中17种TAG、羊油中12种TAG、牛油中14种TAG和鹅油中16种TAG。在分析鸡油和牛油时，实现了SLP和SOP与其各自异构体的分离，表明本方法具有分离TAG位置异构体的能力。采样本方法分离并分析了玉米油、菜籽油、葵花籽油、大豆油、花生油、芝麻油、橄榄油中的三亚油酰基甘油三酯（LLL）的含量。本方法使用的流动相污染小、实用性较好，为食用油中的TAG及其异构体的分析提供了有价值的参考。

    关键词 多孔石墨碳柱; 高效液相色谱法; 质谱; 食用油; 甘油三酯; 正辛烷-异丙醇流动相

    1 引 言

    食用油主要由甘油三酯（TAG）、较低量的甘油二酯（DAG）、游离脂肪酸（FAs）、磷脂和其它微量成分组成[1]。其中，TAG是最重要的营养成分，约占95%[2]。它们构成了人类饮食的重要组成部分[3]，但过量的摄入会导致疾病，如心脏病、血脂异常和肥胖等[4，5]。甘油骨架上脂肪酸的多种组合和不同的TAG位置异构体使其具有多种结构变化。因此，对食用油中TAG成分的分析是一项具有挑战性的工作。

    目前，分离TAG的方法主要有反相高效液相色谱法（RP-HPLC）和高效液相色谱法（HPLC）[6]。 在反相高效液色谱相法中，保留顺序基于碳当量数（ECN），其定义为所有酰基链中的总碳原子数（CN）减去双键数（DB）的两倍，即ECN=CN-2DB[7]。因此，洗脱顺序取决于ECN，保留时间随着ECN的增加而延长，具有相同ECN的TAG可以根据位置[8]、双键的构型[9，10]、脂肪酸的长度和不饱和度进行分离。但是，RP-HPLC对具有相同ECN、但不饱和度不同的TAG的分离选择性较低。Ag+-HPLC也常用于TAG的分离，基于Ag+与TAG的双键的相互作用，TAG的保留时间取决于双键的数量和构型[11，12]，并且随着碳链不饱和度的增加而延长[13]。但是，随着使用时间延长，Ag+-HPLC柱的稳定性下降，重复性逐渐变差[14～16]。因此，应用新型色谱柱的分离方法始终是相关研究的重点内容。

    因不同脂肪酰基在甘油骨架上的位置不同，甘油三酯存在位置异构体。Lísa等[17]利用Ag+-HPLC法分离了OLnLn/LnOLn异构体，但难以分离两个及以上双键的异构体LLnLn/LnLLn。Mikhail等[18]将RP-HPLC和Ag+-HPLC结合，部分分离了两对TAG异构体SOO/OSO和OOP/OPO，但分离度不理想。Nagai等[19]利用CHIRALPAK IF-3手性柱分离了由饱和（P或S）和不飽和（O或L）的两种脂肪酸组成的TAG对映异构体和位置异构体。但是，对于同时包含饱和与不饱和脂肪酸的3种脂肪酸组成的TAG，如POL、PSO和SOL异构体，未充分分离（其中，O、Ln、S、P、L分别指TAG中与甘油连接的油酰基、亚麻酰基、硬脂酰基、棕榈酰基、亚油酰基，其顺序依次对应甘油的3个羟基位置）。

    利用多孔石墨碳柱（PGC柱）分离TAG的方法也逐渐得到研究者关注。PGC色谱柱的刚性和平面表面由六角形排列和共价键合的碳原子组成[20]，耐高压和高温，其物理和化学惰性允许大范围使用多种溶剂，并且在水性流动相的情况下，适用的pH值范围也较宽。其保留机制有3种[21]：疏水效应和分散相互作用，以及溶质的极化和可极化官能团与石墨表面的相互作用，称为石墨的极性保留效应（PREG）。近年来，PGC柱已广泛应用于核苷酸分析[22，23]、萜类化合物[24]、糖类[25～27]、酯类[28～31]、异构体[32，33]、代谢物[34，35]、生物样品[36～40]、离子化合物[41]和手性化合物分析[42]。本研究组[43]曾采用PGC柱和甲苯-异丙醇梯度流动相的LC-MS分离食用油中的TAG，同时，总结出PGC色谱柱中TAG峰保留规律的特殊顺序，定义为S-ECN（S-ECN = 2CN –? – 5uFA）。但是，此方法需要使用质谱检测，对设备的要求较高，而且甲苯毒性高，环境污染严重。Gaudin等[44]利用脂肪酸甲酯同系物的亚甲基选择性，研究有多孔石墨碳的非水液相色谱中10种纯有机溶剂洗脱强度，指出其洗脱强度顺序如下：甲醇<乙腈<丙酮<异丙醇<乙酸乙酯<庚烷<四氢呋喃≈二氯甲烷<氯仿<甲苯。

    本研究建立了一种可用于紫外检测的新流动相体系，采用PGC柱，以正辛烷-异丙醇为流动相，高效液相色谱法等度洗脱分离食用油中的TAG。研究了流动相组成、柱温和流速对TAG分离的影响，在选定的实验条件下，通过与质谱联用，定性识别色谱峰。本方法显示出较好的分离与紫外检测能力，并降低了对环境的污染。

    2 实验部分

    2.1 仪器与试剂

    LCMS-2020型高效液相色谱仪（日本岛津公司），配备两个LC-30AD二元泵、SPD-M20A二极管阵列检测器、SIL-30AC自动进样器、CBM-20A脱气机、以及CTO-30A柱温箱、单四极杆质谱检测器、APCI离子源; N341M型氮气发生器（美国Proton Energy Systems公司）; Hypercarb柱（2.1 mm ×100 mm， 5 μm， 美国Thermo Scientific公司）

    正庚烷、正己烷、异丙醇、乙腈、甲醇、四氢呋喃（色谱纯， 上海泰坦科技有限公司）; 正辛烷（色谱纯，北京迪马欧泰科技发展中心）; 三油酸甘油三酯（OOO）标准品、三亚油酸甘油三酯（LLL）标准品均购自阿拉丁试剂有限公司; 1，3-二油酸-2-棕榈酸甘油三酯（OPO）标准品、1，2-二油酸-3-亚麻酸甘油三酯（OOLn）、1，2-二油酸-3-硬脂酸甘油三酯（OOS）均购自瑞典Larodan精细化学品有限公司。所有TAG标准品均冷冻保存。7种植物油（玉米油、橄榄油、芝麻油、葵花籽油、菜籽油、花生油、大豆油）均购自当地超市; 5种动物油（猪油、鸡油、鹅油、羊油、牛油）均自制，冷藏保存。

    2.2 TAG标准品和食用油样品的配制

    TAG标准品和食用油样品均用正己烷溶解，配制成5 mg/mL储备液，于4℃保存。用流动相将储备液稀释至0.5 mg/mL，每次进样6 μL，用于HPLC分析。

    2.3 色谱和质谱条件

    液相色谱条件： 流动相为正辛烷-异丙醇 （70∶30，V/V），流速0.25 mL/min，温度60℃，紫外检测波长215 nm。

    质谱条件： APCI电离源，正离子电离模式，质荷比范围m/z 500～1100，APCI源温度300℃，DL温度200℃，Heat温度200℃，雾化气流速2.5 L/min，干燥气流速4 L/min，检测电压1.05 kV。分析时间均为45 min。

    2.4 食用油的分离与识别

    取0.5 mg/mL 食用油样品2 μL，进行LC-MS分析，利用流出组分在APCI/MS形成的[M+H]+离子和二酰基甘油碎片离子[M + H-RiCOOH]+鉴定其TAG成分结构。相较于TAG的sn-2位，脂肪酸从同等的sn-1位和sn-3碎裂比较容易，这使得失去sn-1位和sn-3得到的碎片离子相对丰度比失去sn-2位得到的碎片离子相对丰度高。因此，TAG骨架上的烷基链位置可通过碎片离子[M+H-RCOOH]+的不同丰度识别[45，46]。

    3 结果与讨论

    3.1 高效液相色谱条件的选择

    3.1.1 流动相的选择

    为了使TAG能用紫外检测器检测，分别以正庚烷、正己烷、异丙醇、甲醇、乙腈、四氢呋喃作为流动相，比较不同流动相体系的分离效果，包括正己烷-异丙醇、正己烷-异丙醇-四氢呋喃、正己烷-异丙醇-乙腈、正庚烷-异丙醇、正庚烷-异丙醇-乙腈、正庚烷-异丙醇-四氢呋喃等。结果表明，在选定条件（流速0.4 mL/min，温度50℃，流动相比例为80∶20）下，正己烷-异丙醇体系未能分离玉米油中的TAG，而正庚烷-异丙醇体系能够有效分离9种TAG。分别向其中加入乙腈和四氢呋喃，分离效果相差不大。改变温度、比例和流速，后者的分离效果均优于前者。说明正庚烷-异丙醇体系对TAG的洗脱能力更强。进一步采用同系物正辛烷代替正庚烷，考察流动相比例和柱温的影响。在最优流动相比例和柱温条件下，两种流动相体系的玉米油分离谱图见图1。通过质谱图推断出1～10个色谱峰的TAG种类依次是LLLn、LLL、OLL、OOL、PLL、OOO、POL、SLL/POO、PPL、SOL（可与图5A和表7中LC-MS的结果对比，且本研究均不考虑对映异构体）。其中，正庚烷-异丙醇体系未分离识别出LLLn。结果表明，以正辛烷为流动相，保留时间更短，峰数更多，分离更好。从保留时间（t）、信噪比（S/N）、峰数（n）和分离度（Rs）方面对两种流动相体系的分离能力进行比较，结果见表1，正辛烷-异丙醇体系优于正庚烷-异丙醇体系，证明正辛烷的洗脱和分离能力强于正庚烷。因此，本研究选择使用正辛烷-异丙醇作为流动相。有机溶剂在PGC柱上对TAG的洗脱强度排列顺序可总结为：甲苯>氯仿>二氯甲烷≈四氢呋喃>正辛烷>正庚烷>乙酸乙酯>异丙醇>丙酮>乙腈>甲醇。相较于甲苯-异丙醇体系，正辛烷-异丙醇体系紫外吸收本底低，能利用紫外检测而不采用质谱检测器，应用范围更广泛; 相较于甲苯，正辛烷气味小、毒性低、对环境污染小，易于推广使用，更具实用性。

    3.1.2 检测波长的选择 在选定的条件（柱温60℃，流速0.25 mL/min，流动相为正辛烷-异丙醇（70∶30， V/V））下，考察不同紫外检测波长下，玉米油的信噪比。如图2所示，在205～220 nm波长范围内，4种TAG（LLL、OLL、OOL、PLL）的信噪比均在215 nm处最佳。因此，选择215 nm为检测波长。

    Aitzetmulle等[47]测得不同流动相体系（乙醇、乙腈、甲醇、异丙醇、正己烷、四氢呋喃）中TAG最大吸收波长范围在205～225 nm之间，其中，乙醇-异丙醇-正己烷体系的波长也是215 nm。

    3.1.3 流动相比例的影响 在选定的条件（波长215 nm，柱温60℃， 流速0.25 mL/min）下， 考察流动相中正辛烷体积比对分离的影响。 在等度洗脱模式下，以玉米油作为样品， 不同比例正辛烷（50%～90%， V/V）对保留时间、 信噪比、峰数和分离度的影响见表2。当正辛烷的比例增加时，LLL/OLL的分离度逐渐降低，而OOL/PLL的分离度逐渐增加。在正辛烷比例为60%和70%（V/V）时，分離所得的TAG的峰（S/N>3）数最大，且均为10; 但对于70%正辛烷，LLL、OLL、 OOL、 PLL的信噪比 （分别为 49.9、37.8、 11.0、 17.7）比60%正辛烷 （分别为40.5、30.9、8.2、13.6）更高。由图3可见，TAG在石墨碳柱上的保留随正辛烷含量的增加而增加，并且各组分峰的lgk与正辛烷含量具有良好的线性关系，相关系数R2>0.99。4种TAG的变化斜率相似，保留顺序不受正辛烷含量变化的影响。

    比较了等度洗脱模式和梯度洗脱模式， 70%正辛烷在等度洗脱模式下可实现良好分离。梯度洗脱模式为：0～10 mim，50% 正辛烷;10～25 min， 50%～95% 正辛烷; 25～35 min，95% 正辛烷; 35～40 min， 50%正辛烷; 最后平衡5 min。结果表明，与等度洗脱相比，梯度洗脱未能显著提高分离度和信噪比，反而出现基线偏移、分离度下降。采用其它梯度条件，通过提高或降低正辛烷的比例，梯度洗脱的效果也没有提升。因此，本研究选择正辛烷-异丙醇（70∶30， V/V）为流动相， 采用等度洗脱分离。

    3.1.4 温度的影响 在波长215 nm，流动相为正辛烷-异丙醇（70∶30，V/V），流速0.25 mL/min条件下，以玉米油为样品，考察了温度（30℃～80℃）对4种TAG（LLL、OLL、OOL、PLL）分离的影响。如表3所示，随着温度升高，TAG的保留降低， LLL/OLL和OOL/PLL的分离度也逐渐降低。但TAG的信噪比大， 增峰数呈上升的趋势; 同时， 保留时间缩短，流动相的洗脱能力加强。? 在60℃和70℃时， 分离所得的TAG的峰（S/N>3）数达到最佳（均为10个）。两种温度下，LLL、OLL、OOL、PLL的信噪比相差不大，同时，LLL/OLL的分离度相差不大（Rs>2），但是，60℃时OOL/PLL的分离度（1.35）比70℃时（1.05）略高，分离更完全。选择LLL、OLL，OOL和PLL研究lgk和温度（1/T）之间的关系。如图4所示， 随着温度升高，保留时间缩短，分离度下降。在30℃～80℃范围内，4种TAG的lgk-1/T的趋势没有交叉，并且4条关系曲线均具有良好的线性关系， 相关系数R2>0.99。因此，在30℃～80℃，TAG在石墨碳柱上的保留机理和保留顺序没有变化; 60℃和70℃的出峰数相同且最大，但60℃的信噪比和分离度都优于70℃。后续实验的柱温选择60℃。

    3.1.5 流速的影响

    在波长215 nm，正辛烷-异丙醇（70∶30， V/V）流动相，柱温60℃的条件下，以玉米油为样品，考察流速（0.2～0.4 mL/min）对4种TAG（LLL、OLL、OOL、PLL）分离的影响。如表4所示，随着流速增加，TAG的保留时间缩短，信噪比增大，但LLL/OLL和OOL/PLL的分离度逐渐减小，柱压升高。由于不同流速下所得的峰数相同，为了使信噪比和分离度更大，洗脱时间更快，选择0.25 mL/min作为后续实验的流速。

    3.2 方法学验证

    3.2.1 重复性 在优化的实验条件下，以玉米油为样品，考察4种TAG（LLL、OLL、OOL、PLL）保留时间和峰面积的日内重复性和日间重复性，均重复6次。日内重复性的保留时间相对标准偏差（RSD）分别为0.34%、0.33%、0.50%和0.29%，峰面积的RSD分别为0.29%、0.49%、0.98%和0.69%。日间重复性，保留时间的RSD值分别为0.71%、0.83%、0.72%和0.65%，峰面积的RSD值分别为1.3 %、1.4%、1.2%、1.3%。日内重复性RSD均小于1%，日间重复性RSD值均小于2%。因此，本方法重复性较好。

    3.2.2 线性范围、检出限和定量限 使用LLL、OOO、SOO、OPO和 OOLn作为样品，考察峰面积和进样溶液中组分含量（μg）之间的线性关系（表5）。5种TAG在含量范围内有良好的线性关系，相关系数R2>0.99。利用线性回归方程的残余标准偏差和斜率计算检出限（LOD， 3σ）和定量限（LOQ， 10σ），见表5。

    3.2.3 加标回收率 LLL、OOO、OOLn、OPO和SOO在食用油中的含量差异较大，选择含量达到定量限或不含有此TAG的食用油作为样品，计算加标回收率。玉米油中LLL的含量达到定量限; 橄榄油中OOO的含量达到定量限，并且不含有OOLn、OPO和SOO。因此，选择这两种油作为样品分别计算5种TAGs的加标回收实验。分别取3种不同浓度的LLL、OOO、OOLn、OPO和SOO标准品，分别加入到玉米油或橄榄油中，各加标水平均重复3次。结果（表6）表明，LLL、OOO、OOLn、OPO和SOO的加标回收率在91.7%～108.9%之间，RSD均小于4%。

    3.3 利用LC-MS定性鉴别食用油样品中的TAG

    采用PGC柱，以正辛烷-异丙醇为流动相，结合LC-MS对7种植物油和5种动物油进行分析，总离子流图见图5和图6。根据2.5节的方法鉴别12种食用油中的TAG。结果表明，鉴别出玉米油中14种TAG、橄榄油中9种TAG、葵花籽油中14种TAG、大豆油中14种TAG、芝麻油中15种TAG、花生油中18种TAG、菜籽油中17种TAG、鸡油中16种TAG、猪油的17种TAG、羊油中的12种TAG、牛油中14种TAG和鹅油中16种TAG（S/N>3）。玉米油和猪油TAG的定性鉴别结果分别见表7和表8。

    计算结果显示，各种油样中TAG的顺序与本研究组采用甲苯流动相研究得出的结果[41]一致，均符合：

    S-ECN=2CN-3DB-5uFA（1）

    其中， S-ECN为碳当量数，CN为总碳原子数，DB为双键数和uFA为不饱和脂肪酸数。结果表明，正辛烷-异丙醇体系与甲苯-异丙醇體系具有相似的保留机理。

    PGC具有刚性和平面表面，对TAG具有很强的保留，正辛烷作为流动相，与溶质在PGC表面发生竞争，促进不同TAGs的洗脱和分离。通过与质谱联用，分析12种食用油， TAG的出峰顺序与方程（1）一致，表明此规律有助于推测TAG的保留及识别色谱峰。采用PGC柱的高效液相色谱法中，部分TAG的保留顺序与反相液相色谱的模式存在明显差异，表明TAG组分中不饱和脂肪酸（即不饱和酰基）的个数增加，会降低其在PGC柱的保留。

    3.4 利用LC-MS分析TAG位置異构体

    在对鸡油和牛油分析谱峰的定性识别时，PGC柱对TAG位置异构体有一定的分离能力。SOP/SPO（或/和PSO，下文直接简写成PSO，详见下面的讨论）和PSL/SPL（或/和PSL）两对位置异构体的分离情况

    （因为质谱识别的特点，未考虑对映体的差异，sn-1位和sn-3位的脂肪酸可能互换或者两者同时存在）如图7所示，PLS的保留时间比SPL（PSL）短，SOP的保留时间也比SPO（PSO）短。这两对异构体中碎片离子的相对丰度如图8所示，与sn-1和sn-3位置上的碎裂酰基的[M+H-RCOOH]+离子相对丰度比相比，sn-2位置上碎裂酰基的[M+H-RCOOH]+离子相对丰度更低，这可能是由于立体定向的阻断作用[47，48]。图8A中[SP]+/[SL]+和[SP]+/[PL]+两对丰度比均为0.70，仅[SP]+小，可以直接识别为SLP; 而图8B中，两者均在2.46附近，[SL]+和[PL]+都小，故推测图8B可能为SPL或者PSL，也可能是两者的混合物（简写成SPL（PSL））。同样，图8C仅[SP]+小，故识别为SOP，而图8D中[SO]+和[PO]+都小，故推测图8D可能为SPO或PSO，也可能是两者的混合物（简写成SPO（PSO））。

    在非水反相色谱法中，在TAG的sn-1位或sn-3位含有的不饱和脂肪酸越多，保留时间越长[49]。而本研究中，当TAG中不饱和脂肪酸位于sn-1位或sn-3位时，其保留明显比其位于sn-2位的TAG更强。这说明当不饱和脂肪酸位于sn-1位或sn-3位时，不饱和脂肪酸更易与PGC柱的表面产生强烈的相互作用，使得吸附更紧密，保留增强。上述异构体的分离也有类似现象。

    3.5 HPLC-UV法定量分析食用油样品

    将建立的HPLC-UV方法用于不同食用油样品的定量分析，每个油样重复测定3次。考虑到目前仅LLL的紫外检测灵敏度较好（对其它TAG成分检测灵敏度的改进还在研究中），仅定量分析了植物油中的LLL。如表9所示，检测的植物油中均含有LLL，其中，橄榄油和菜籽油中的LLL含量相对较低，其它植物油中LLL的含量均大于0.1 g/g。

    4 结 论

    建立了使用PGC柱和正辛烷-异丙醇流动相，在紫外检测条件下分离食用油中TAG的高效液相色谱方法。考察了实验条件对分离和检测的影响。在优化的实验条件下，分离了7种植物油和5种动物油中的TAG，与质谱联用，对不同食用油中的TAG成分进行了定性鉴别，显示本方法可以分离TAG的两对异构体PLS/SPL（PSL）和SOP/SPO（PSO）。实验结果表明，有机溶剂在PGC柱上对TAG的洗脱强度排列顺序为：甲苯>氯仿>二氯甲烷≈四氢呋喃>正辛烷>正庚烷>乙酸乙酯>异丙醇>丙酮>乙腈>甲醇。正辛烷-异丙醇流动相与甲苯流动相用于PGC柱分离TAG具有相似的保留机理。采用本方法测定了玉米油、菜籽油、葵花籽油、大豆油、花生油、芝麻油、橄榄油中LLL的含量。本方法对食用油中的TAG及其异构体的分析具有良好的的参考价值。

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    Separation and Determination of Triacylglycerols in Edible Oils

    by High Performance Liquid Chromatography with

    Porous Graphite Carbon Column and

    n-Octane-isopropanol Mobile Phase

    LU Xiang-Ting， ZHANG Shi-Ding， GONG Can， XU Xu*

    （School of Chemical and Environmental Engineering， Shanghai Institute of Technology， Shanghai 201418， China）

    Abstract High performance liquid chromatography with porous graphite carbon （PGC） columns and a n-octane-isopropanol mobile phase was used to separate triacylglycerols （TAGs） in edible oils. The samples were separated by a Hypercarb column （2.1 mm × 100 mm， 5 μm） with n-octane-isopropanol （70∶30， V/V） as mobile phase at a flow rate of 0.25 mL/min and column temperature of 60℃， with detection wavelength of 215 nm. The experimental conditions were optimized. Then， TAGs in 7 vegetable oils and 5 animal fats were separated under the selected experimental conditions. A total of 14 TAGs in corn oil， 9 TAGs in olive oil， and 14 TAGs in sunflower oil， 14 TAGs in soybean oil， 15 TAGs in sesame oil， 18 TAGs in peanut oil， 16 TAGs in rapeseed oil， 19 TAGs in chicken fat， 19 TAGs in lard， 12 TAGs in sheep fat， 13 TAGs in beef tallow and 16 TAGs in goose fat were identified by combining with mass spectrometry. By means of analysis of chicken fat and beef tallow， it was found that the SLP and SOP could be all separated with their respective isomers， which indicated that the system could separate the TAG isomers. The method was validated and applied to determine LLL in corn oil， rapeseed oil， sunflower seed oil， soybean oil， peanut oil， sesame oil and olive oil. The practical method used less-polluting mobile phase to provide a valuable method for the analysis of triacylglycerols and its isomers in edible oil.

    Keywords Porous graphite carbon column; High performance liquid chromatography; Mass spectrometry; Edible oils; Triacylglycerols; n-Octane-isopropanol mobile phase

    （Received 6 January 2020; accepted 26 February 2020）

    This work was supported by the National Natural Science Foundation of China （No. 31671928） and the Natural Science Foundation of Shanghai， China （No. 15ZR1440800）

    2020-01-06收稿; 2020-02-26接受

    本文系國家自然科学基金项目（No. 31671928）和上海市自然科学基金项目（No. 15ZR1440800）资助

    * E-mail： xuxu3426@sina.com