枯萎镰刀病菌侵染西瓜幼苗的过程特征

    张曼 徐锦华 刘 广 姚协丰 李苹芳 羊杏平

    目的与意义： 西瓜枯萎病是由尖镰孢菌西瓜专化型侵染引起的维管束系统病害，是国内外西瓜生产上最严重的病害之一，已成为制约西瓜生产的主要障碍。而有关枯萎病菌侵染途径及植株抗病反应机制尚不明确。本项研究以期明确西瓜枯萎病菌在西瓜幼苗中的侵染过程，及其侵染后西瓜植株的组织结构变化与相关防卫基因的表达，进而探讨组织结构变化和防卫基因的表达与抗病性的关系。

    材料与方法： （1）采用农杆菌介导的遗传转化方法将pGFP载体导入枯萎病菌基因组。（2）采用Leica CP SP2（Germany）激光共聚焦显微镜实时观察菌丝侵染过程。记录的图形数据导入Adobe Photoshop7.0进行处理。（3）采用XL30 ESEM扫描电镜观察植株的组织结构。（4）采用ABI PRISM7300实时定量PCR仪进行Real-time PCR分析。采用2?ΔΔCT 法分析数据，确定基因的相对表达量。采用SAS 9.2（SAS Institute， Cary， NC）软件进行统计学分析。

    结果与分析： （1）枯萎病菌接种后7 d，植株开始显症。叶片萎蔫，子叶枯萎下垂。接种后15 d，植株发病率达81.2%，大部分受侵染的植株基部变褐缢缩，有时有胶状物流出，发病植株猝倒，干枯死亡。接种后21 d，96%的植株完全枯萎死亡。（2）菌丝侵染途径观察结果表明，接种后4 h，孢子松散的附着在根表皮，12 h，个别孢子萌发产生菌丝，接种后2 d，可见菌丝大量紧密附着于根毛。接种后3 d，小分生孢子和成熟菌丝向皮层渗透。接种后6 d，分生孢子已经到达木质部导管。而受侵染植株从表型上看长势健壮、无病害症状。接种后7 d，菌丝进入到木质部导管。植株开始出现萎蔫症状。接种后10 d，植株出现明显病害症状，如基部变褐缢缩、发病植株猝倒等。此时，可见根和下胚軸木质部导管中遍布菌丝。接种后15 d，大部分侵染植株（81.2%）死亡。（3）组织结构观察结果表明，接种后2 d，进入腔内的菌丝周围出现胶状物质，这种物质在病原菌刚进入导管后不久便出现，是寄主对病原菌入侵的快速反应。随着菌丝的进一步侵染，接种后5 d，受侵染组织周围、甚至整个维管腔周围的薄壁细胞细胞壁出现加厚现象，对菌丝的横向扩散起到了阻碍作用。接种后7 d，在木质部导管内部出现了侵填体。侵填体形成初期，在管壁上首先看到多个小的突起，这些小突起逐渐长大，至接种后11 d，可见导管被一个或多个侵填体所堵塞。同时，接种后7 d，薄壁细胞细胞壁慢慢溶解，并导致空洞形成。当维管组织被胶状物大面积覆盖，且被侵填体严重堵塞时，被侵染的维管组织会启动脱落程序。接种后11 d，被破坏的组织首先从管壁上分离，随后脱落，接种后15 d，根部维管系统中空。（4）防御基因表达分析结果表明，枯萎病菌侵染显著诱导了ClPDF2.1基因的表达。侵染后2 d和7 d的表达量分别较对照升高了1.5倍和1.7倍。与ClPDF2.1基因不同的是，侵染后2 d，ClPDF2.4基因的表达较对照升高2.1倍，随后表达量急剧下降，侵染后7 d，表达量仅比对照提高1.1倍。PAL基因的表达随枯萎病菌侵染而逐渐增高。侵染后2 d，PAL基因的表达量为对照的1.4倍，至实验结束，其表达量为对照的1.5倍。CHI基因的诱导表达模式与PAL基因相同，但基因表达量要高于PAL基因。APX基因的表达模式与ClPDF2.4基因相同，侵染后2 d表达量升高，随后下降。枯萎病菌侵染没有诱导PPO基因的表达，在整个实验期没有检测到表达量的差异。

    结? ? 论： 本研究明确了枯萎病菌的侵染过程，即接菌后3 d，菌丝在根表皮附着生长，之后菌株开始穿过表皮细胞向皮层侵染，接菌后7 d菌丝侵入维管束，此后沿维管束向上侵染。枯萎病菌的侵染过程中，西瓜根部木质部导管通过快速形成膜状物、侵填体及细胞壁增厚阻塞菌丝入侵。同时，ClPDF2.1、PAL、CHI等防御基因随枯萎病菌侵染表达量升高。表明，植株一方面通过快速的组织结构响应，另一方面从转录水平提高了相关防卫基因的表达，提高植株的抗病性。