角质形成细胞生长因子促进大鼠皮肤伤口局部血管化效果研究

    张凯 曹聪 余孟流 光梦凯 钟波 徐宝华

    [摘要]目的：探索角质形成细胞生长因子（Keratinocyte growth factor，KGF）对于大鼠皮肤伤口局部的促血管化作用。以探究其可能的促进愈合的机理。方法：构建大鼠背部皮肤全层缺损模型，随机分为空白组（不作特殊处理），空白膜组（放置空白胶原膜），KGF膜组（放置加载KGF的胶原膜）。通过大体标本观察，组织学染色、免疫双标染色等技术对术后7d和14d时伤口的血管化程度进行比较和分析。结果：术后通过大体标本观察，可看到空白组和空白膜组虽均有血管长入伤口内，但中心部位血管化程度低于KGF膜组。Masson染色和免疫荧光染色及局部血管计数也证实加载KGF的胶原膜可以促进局部血管再生。结论：KGF可以促进大鼠皮肤伤口愈合过程中的血管化作用。

    [关键词]角质形成细胞生长因子;皮肤伤口;伤口愈合;胶原膜;血管化

    [中图分类号]R622? ? [文献标志码]A? ? [文章编号]1008-6455（2021）01-0086-03

    Keratinocyte Growth Factor Promotes Vascularization of Rat Skin Wounds

    ZHANG Kai，CAO Cong，YU Meng-liu，GUANG Meng-kai，ZHONG Bo，XU Bao-hua

    （Stomatology Center，China-Japan Friendship Hospital，Beijing 100029，China）

    Abstract： Objective? This article aims to explore the pro-angiogenic effect of KGF on rat skin wounds. Methods? After successful modeling of full-thickness defect， 12 rats were randomly divided into three groups. The blank group was not treated. Blank collagen membrane was placed in the blank membrane group. Collagen membrane loaded with KGF was placed in the KGF membrane group. The degree of vascularization of the wounds at 7 and 14 days after surgery was compared and analyzed. Analysis was performed by gross specimen observation of wounds， histological staining， and immunolabeling. Results? Through the observation of gross specimens， it can be seen that although wounds in the blank group and the blank membrane group have blood vessels that grow into the wound， the degree of vascularization in the central part was lower than that in the KGF membrane group. Masson staining and immunofluorescence staining also confirmed that collagen membranes with sustained release of KGF promoted local angiogenesis. Conclusion? KGF can promote the vascularization of rat skin wound healing process.

    Key words： keratinocyte growth factor（KGF）; skin wound; wound healing; collagen membrane; angiogenesis

    發生在颜面部的皮肤损伤，如果发生延迟愈合或瘢痕愈合会很大程度影响患者的美观及功能。研究证实，血管化在皮肤愈合中起到十分关键的作用。如果缺少血管的滋养，新生上皮容易产生瘢痕，可能导致上皮化不完全，机械性能差等，因此血管化不足是决定和制约皮肤修复效果的关键因素之一[1-2]。研究发现，在皮肤受伤后，局部分泌多种细胞因子在真皮与表皮之间起重要的桥接作用，参与皮肤的愈合，改建及角化[3]。其中角质形成细胞生长因子（Keratinocyte growth factor，KGF）在正常皮肤中表达量较低，但皮肤受伤后KGF在短期内上调，提示其在伤口愈合和皮肤再生中起到关键作用。特定作用于上皮细胞，是成纤维细胞-角质形成细胞交互作用的关键分子[3]。已有研究证实外源性KGF可以促进皮肤伤口的愈合[3-4]，因此本研究旨在探索KGF对于缺损局部血管化的促进作用。

    1? 材料及方法

    1.1 主要试剂及仪器：胶原膜（登腾，韩国），角质形成细胞生长因子（Keratinocyte growth factors，KGF，Genoss，韩国），2-吗啉乙磺酸[2-（N-Morpholino） ethanesulfonic acid，MES，西格玛，美国]，N-羟基琥珀酰亚胺（N-hydroxysuccinimide，NHS，西格玛，美国），1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐[1-（3-Dimethylaminopropyl）-3-ethylcarbodiimide hydrochloride，EDC，西格玛，美国]，抗CD31单克隆抗体（ab64543，Abcam，美国），抗α-SMA单克隆抗体（ab18147， Abcam，美国）。

    1.2 方法

    1.2.1 生长因子加载：将直径1cm的胶原膜材料经过EDC/NHS（含0.5M EDC和0.5M NHS的MES溶液）溶液浸泡16h，再转移至1ml相应的KGF溶液中在4℃环境下浸泡16h。KGF溶液浓度为10ng/ml。

    1.2.2 动物实验分组及模型：本文采用8周SD大鼠背部皮肤模型进行软组织愈合评价。12只大鼠随机分3组，背部备皮，消毒，制作4个圆形（直径8mm）全层皮肤伤口，潜行剥离后放置不同处理的胶原膜（直径1cm），表面被覆Tegederm（3M，美国）及硅胶圈，缝合固定。空白组不作处理;空白膜组放置空白胶原膜;KGF膜组放置加载KGF的胶原膜。

    1.2.3 大体解剖观察：7d及14d分别处死，将伤口区域皮肤标本沿硅胶圈外沿5mm左右剪下。将新鲜标本被覆在强光源表面，因皮肤有一定透光度，可以直接对血管形成情况进行观察。

    1.2.4 组织学染色：将标本置于4%多聚甲醛中固定，常规石蜡包埋，切片进行HE染色，Masson三色染色及CD31和α-SMA免疫双标染色。在显微镜下观察软组织愈合情况及血管化程度。

    2? 结果

    2.1 大体标本血管化观察：如图1，14d伤口区域肉眼观可见几组均有血管从周围向伤口中心汇聚性长入。空白组虽有周围大血管长入硅胶圈内，但伤口中心区皮肤发白，中间形成明显的乏血管区，类似瘢痕组织形成;空白膜组血管形成较A组稍均匀，呈红色云雾状，但中心区仍有小部分泛白的区域。相较而言KGF膜组不仅周围有大血管延伸至标本中心，且伤口中心形成了较均匀的红色小血管网，偶有较粗的大血管贯穿。提示KGF膜组血管化程度高于空白组和空白膜组。

    2.2 血管免疫双标染色：术后7d时CD31（绿色）及α-SMA（红色）免疫双标染色如图2所示。在空白组和胶原膜组中可见散在的α-SMA阳性细胞形成管腔样结构，但CD31阳性细胞散在在视野中，并未形成管腔样结构。KGF组可见内层绿色，外层红色的双染管腔样结构，提示KGF组有成熟的血管组织形成。14d时，三组均可观察到明显的管腔样血管结构，但空白组仍只能观察到红色管壁，未见明确绿色内衬结构。空白膜组部分血管可见双层共染色。但与前两组相比较，KGF膜组明显可以观察到高密度成熟血管结构，几乎所有血管均可见双层红绿共染色的管腔结构。

    2.3 组织学染色观察：术后14d大鼠伤口新生皮肤组织Masson染色结果显示：空白组（见图3A）上皮层完全未形成，视野中仅有蓝色结缔组织，且几乎不可见红染的新生血管。空白膜组（见图3B）中可以看到红蓝相间的胶原膜仍被覆在伤口表面，胶原膜降解尚未完成。胶原膜下可见一层暗红色血痂，血痂下的结缔组织中可见少量红色小血管散在分布。KGF膜组（见图3C）已可观察表面形成一层致密深染纤维，提示上皮层逐渐形成中。在下层的结缔组织中明显观察到高密度新生血管，其中可见红细胞充盈，说明形成了成熟的功能血管。进一步对各组高倍镜下毛细血管密度进行了计数分析，可以得出KGF膜组的镜下血管密度显著高于空白组和空白膜组。

    3? 讨论

    由创伤、烧伤、烫伤、糖尿病溃疡等引起的急慢性皮肤缺损是一类常见病症[5-6]。组织工程的发展，为解决大面积皮肤缺损时自体皮源不足提供了新的思路和方法[7]。本文通过制备加载KGF的胶原膜，为皮肤再生提供了新的思路。

    KGF又被称为成纤维细胞生长因子-7（Fibroblast growth factor-7，FGF-7）是成纤维细胞生长因子家族的成员。最早由Rubin等（1980）从人类胎肺成纤维细胞培养液中分离提纯获得的。由间充质细胞特别是成纤维细胞分泌，特定地作用于上皮细胞，包括皮肤，肺及消化道黏膜等[8]。

    血管化过程是伤口愈合程度的关键指標之一，本研究侧重于讨论KGF在伤口血管化方面作用。大体标本和组织学切片均验证了KGF对于局部新生血管的促进作用，这种促进不仅体现在血管的数量，而且体现在KGF组的血管成熟程度较高，说明行使功能的血管比例较高。笔者认为，KGF促进血管化的可能机制有以下几方面：①作为促有丝分裂因子，既往的研究表明KGF可以直接作用于微小血管内皮细胞[9]，并促进细胞增殖和迁移，且其作用基本与同计量bFGF相当;②KGF通过调节与成血管相关因子的释放而间接影响血管化。研究表明，KGF可以促进角质形成细胞分泌VEGF，既协同VEGF的促血管新生作用，又抑制VEGF介导的红细胞渗溢[10]。从而形成更完整更成熟的血管;③成熟的血管除了内衬的内皮细胞之外，还需要包裹的血管肌细胞协同，才能行使功能。Peng等[11]还发现KGF在伤口愈合中可以促进α-SMA蛋白分泌，进而促进伤口收缩，以加快创面关闭。同时α-SMA也是血管平滑肌的重要标志物，因此推测，KGF也可以通过血管平滑肌途径来促进伤口的血管化。本研究中也通过免疫荧光染色证实，KGF组确实有更多成熟的α-SMA蛋白的表达。综上，这些结果均提示KGF在血管再生的各个不同时期都起到了调节作用。为本实验的观察结构提供了理论依据。但本研究具有一定的局限性，目前的分析仅停留在现象的观察，后续研究可以深入探讨KGF通过激活哪些通路带来相应的效果。

    同时，KGF对于伤口愈合的促进作用可能不仅在于其对血管化的促进。在伤口修复过程中有许多细胞因子参与，但只有KGF是仅由间充质细胞产生[12]。提示KGF作为一种旁分泌介质主要调节间充质-上皮交通（epithelial–mesenchymal interactions），对于上皮屏障的功能维持以及伤口愈合起关键作用[8]。

    本实验还通过组织学染色还发现，KGF组胶原膜降解速度快于空白膜组。原始的胶原膜结构消失，较早地演变为早期新生上皮结构。材料在体内的降解过程与免疫细胞募集相关，特别是巨噬细胞在其中扮演重要角色，Gardner等发现KGF在肺组织中可以增强巨噬细胞功能，加速对肺组织中细菌的清除[13]。据此，笔者推测在本实验中KGF也通过上调局部免疫功能，加速胶原膜吸收，从而加速了正常皮肤组织对于材料的替代。

    总之，KGF可以在创面愈合的多个阶段发挥作用，且胶原膜可以作为其载体释放KGF。但其作用机制需要更加深入地研究进行探索。作为已经被FDA批准使用的药物，如果KGF对于皮肤创面愈合的积极作用及安全性得到充分验证，相信KGF很快可以用于临床中面积较大的伤口或迁延不愈伤口的治疗。

    [参考文献]

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    [收稿日期]2019-12-02

    本文引用格式：张凯，曹聪，余孟流，等.角质形成细胞生长因子促进大鼠皮肤伤口局部血管化效果研究[J].中國美容医学，2021，30（1）：86-88.