单细胞质谱分析方法研究进展

    王举铎　宋佳峰　李畅　戴新华　方向　龚晓云　叶子弘

    

    

    

    摘 要 细胞的个体差异性对于生物体生理功能的运行至关重要， 准确阐释相关生物学机理需要以单细胞化学组分的准确测量为基础。然而，由于单细胞中的物质含量低、组成复杂，且不同物质的含量差异大，导致单细胞分析的技术难度极大。质谱技术凭借其高灵敏度、高特异性，以及强大的结构解析能力，近年来在单细胞分析研究中得到了广泛应用。研究者已建立了多种质谱分析方法，实现了单细胞中不同物质的准确测量。从离子化技术的角度，单细胞质谱分析方法目前主要包括三类，即纳升电喷雾离子化质谱法、激光解吸附离子化质谱法和二次离子质谱法。本文对近年基于上述三种离子化技术的单细胞质谱分析方法的研究进展进行了归纳和总结，对单细胞质谱分析方法未来的发展趋势进行了展望。

    关键词 质谱; 单细胞分析; 离子化; 纳升电喷雾离子化; 激光解吸附离子化; 二次离子质谱; 评述

    1 单细胞分析方法的研究意义

    细胞是生物体结构和功能的基本单位。细胞具有显著的异质性，这种个体差异性的存在，对于生物体生理功能的正常运行至关重要。为了更深层次地了解生命活动的本质，获得更全面和精准的细胞生物学信息，必须从单细胞水平进行相关研究[1]。目前，单细胞分析主要进行细胞表型、基因型和化学组分的准确测量[2]，形成了单细胞多组学研究，在细胞生物学和临床医学等基础和应用科学领域得到了广泛应用[3，4]。

    单细胞分析的实现有许多需要解决的技术难题[5]。首先，单细胞的体积微小，导致一些传统的分离富集操作手段难以实施;其次，单细胞中的物质含量极低，许多物质只有amol级别甚至更低，对测量方法的灵敏度提出了极高要求;再次， 单细胞中的物质组成复杂，不同物质之间存在相互干扰，尤其是结构类似物之间，对检测方法的特异性提出了较高要求。此外，细胞内和细胞间许多复杂的动态生理过程也会对测量结果带来影响[1]。

    目前，研究者已建立了一些单细胞分析方法，包括荧光成像法、电化学法，以及质谱法等。荧光成像法通过荧光探针对目标分子进行标记，可实现对目标组分含量和空间分布的实时监测[6，7]。然而，荧光成像法需要对目标分子进行标记，过程较为复杂，并且会改变待测分子的理化性质，这使得荧光成像的检测对象范围受到了较大的限制。电化学法可对目标物质进行实时定量分析，在神经元电生理活动和神经递质分泌等研究中得到了广泛应用[8]。然而，电化学方法要求目标物质能形成氧化还原电对，对于很多不易发生氧化还原反应的物质，电化学法难以进行检测;此外，电化学法难以进行多组分同时分析。

    近年来，质谱（Mass spectrometry， MS）技术作为一种高灵敏度、高特异性和非标记检测技术在单细胞分析中得到了越来越广泛的应用。它不仅可实现多组分同时分析，还可对待测分子结构进行解析。目前，研究者已经发展出基于不同离子化技术的单细胞质谱分析方法。其中有三类最具代表性，包括纳升电喷雾离子化（Nano-electrospray ionization， Nano-ESI）、激光解吸附离子化（Laser desorption ionization， LDI）和二次离子质谱（Secondary ion mass spectrometry， SIMS）， 这三类方法互为补充，各具优势。本文主要对近年出现的一些代表性技术与方法进行总结，对单细胞质谱分析方法的前沿研究动态进行了综述。

    2 单细胞质谱分析方法研究的最新进展

    2.1 基于Nano-ESI的單细胞质谱分析法

    Nano-ESI是一种具有高离子化效率的“软”离子源技术，在生命科学中具有非常广泛的应用[9，10]。将溶液样品置于纳喷雾喷针（Nano-tip）中，通过电极向样品溶液施加高压电（1～2 kV）。在高压电场的作用下，样品溶液从Nano-tip尖端喷出，形成电喷雾。基于Nano-ESI的单细胞分析方法一般使用Nano-tip进行取样[11]。在显微镜的实时观察下，通过三维移动机械臂控制Nano-tip从活体细胞的目标区域直接取样。取样后，可通过Nano-ESI进行直接离子化检测，或通过与毛细管电泳等分离技术联用，对不同化合物进行分离，然后再检测。同其它离子化技术相比，Nano-ESI具有直接、快速和活体取样的优势，检测过程中无需基质和真空等特殊条件。近年来，随着检测需求的不断提高，研究者从取样、分离和离子化等技术层面对基于Nano-ESI的单细胞分析方法进行了改进和提升。

    在取样技术的研发方面， Zhang等[12]提出了一种基于液滴微萃取的单细胞取样方法。该方法首先在Nano-tip尖端吸入萃取溶剂，然后将溶剂滴加到细胞的表面，将细胞代谢物萃取到液滴中，再将液滴吸回至Nano-tip中用于后续的检测。通过改变溶剂，利用不同化合物在溶剂中溶解性的不同，可在一定程度上实现不同种类化合物的分离和检测，同时降低盐和培养基等干扰基质的影响[13]。为提高萃取效率，实现定量检测，Feng等[14]进一步发展了一种阵列液滴微萃取技术（图1）。阵列的使用避免了萃取溶剂的不规则扩散，提高了萃取效率和萃取过程的可控性。通过添加同位素内标，可实现对细胞代谢物的定量分析。

    Liu等[15]发展了一种更为便捷的“T”字形微型多功能取样探针，用于贴壁细胞的取样和分析。该探针使用计算机微刻蚀的聚碳酸酯材料作为基底，通过夹持的方式将两个Nano-tip和一根毛细管通过一个三通接口，以“T”字形方式集成在一起。一个Nano-tip用于取样，将细胞质吸入探针中，经过三通接口，在毛细管溶剂的带动下进入用于喷雾的另一个Nano-tip，实现离子化。该探针将取样和离子化过程衔接在一起，减少了前处理时间，提高了检测灵敏度和重现性。通过扩大取样Nano-tip的内径，将单细胞直接吸入探针中，还可实现对悬浮细胞的取样和分析[16]。

    Yin等[17]发展了一种基于局部电渗流萃取的定量分析方法。该方法在探针内部填充了疏水性电解质溶液， 探针内和细胞培养基中分别放置了一根电极， 在两根电极上施加特定电压，利用电渗流将代谢物从细胞中萃取至探针内部。取样完成后，再将探针置于内标溶液中，萃取适量内标至探针中，进行定量分析。该方法避免了对细胞质的直接抽取，通过电渗流进行目标分子萃取的方式更容易操控。

    Cahill等[18]发展了一种具有更高通量的取样方法。该方法将单细胞打印机技术（Single cell printer， SCP）与液相涡旋俘获技术（Liquid vortex capture， LVC）相结合，实现单细胞样品的制备与细胞代谢物的有效萃取（图2）。单细胞打印机利用压电喷射原理产生包裹单个细胞的小液滴，实现对不同细胞个体的分离。产生的单细胞液滴进入俘获装置的萃取溶剂中，经过细胞裂解和萃取，进入质谱离子源中实现离子化。该方法检测通量明显高于其它方法。但由于单细胞打印机在打印过程中无法对细胞进行定位和筛选，因此该方法无法针对特定目标细胞进行检测分析。

    为降低不同化合物之间的相互干扰，提高化合物的鉴定数量，痕量物质分离技术如毛细管电泳（Capillary electrophoresis， CE）和纳升液相色谱（Nano-liquid chromatography， NanoLC）被用于单细胞样品的分离。Kawai等[19]发展了一种改进的CE系统，实现了对单细胞代谢物的高灵敏度分析。该系统使用了一种基于等速电泳和堆积原理的大体积双重预富集技术。该技术在实施过程中，在毛细管两端施加了一个逆向液相压力，通过场放大样品堆积效应让代谢物富集于毛细管的前端，同时分离掉背景基质。之后停止施加液相压力，通过等速电泳实现代谢物的有效分离和检测。该方法可兼容较大的样品体积，为单细胞样品前处理提供了便利。

    Kelly课题组发展了一种基于NanoLC的单细胞蛋白质组学分析方法[20]。该方法使用了一种内径为20 μm的自主填充毛细管NanoLC柱进行单细胞蛋白质酶解样品的分离， 样品由课题组之前所发展的原位纳米液滴痕量样品处理技术制备[21]， 细胞裂解、烷基化和酶解等过程均在原位液滴中完成。通过上述方法，实现了单个宫颈癌细胞（Hela）中300种以上蛋白质的组学分析。

    在离子化技术的改进方面，主要是提高离子化效率和基质耐受性以获得更高的检测灵敏度，以及延长离子化时间以获得更多代谢物的检测信息。Huang课题组将前期工作中发展的诱导纳喷雾技术（Induced nano-ESI， InESI）[22]与膜片钳技术相结合，用于单细胞样品的分析[23]。InESI的电极与样品溶液不直接接触，交流高压电场间接作用于样品溶液产生喷雾，避免了电极反应对样品组分带来的干扰，延长了离子化时间，提高了基质耐受性。利用该方法实现了单个神经细胞中超过50种重要代谢物的快速分析[23]。通过进一步结合电生理学、分子生物学以及动物行为学技术，揭示了小鼠脑内由尿刊酸（Urocanic acid， UCA）合成谷氨酸的代谢新通路，及其参与日光照射改善小鼠学习和记忆能力的分子与神经环路机制（图3）[24]。

    Zhang课题组将前期研究中发展的液滴微萃取取样方法[12]与皮升电喷雾技术（Pico-ESI）相结合，实现了单细胞代谢物的组学分析[25]。Pico-ESI也是一种电极非接触式纳喷雾离子源， 与InESI所不同的是，Pico-ESI使用了脉冲直流电场实现纳喷雾的发生。Pico-ESI的金属电极需要插入Nano-tip中，但是与样品溶液无接触。Pico-ESI可极大地延长喷雾时间，从而获得更多的谱图信息。采用该方法可实现人腦胶质母细胞瘤细胞（A172）中三百余种磷脂的检测。

    虽然基于Nano-ESI的单细胞分析方法在活体单细胞分析中具有很多优势，也取得了许多研究成果，但总体而言，这类方法在操作上较为繁琐，尤其是取样过程需要人为控制三维移动机械臂夹持Nano-tip对单细胞进行逐一取样，费时费力，通量不高。此外，这类方法无法进行成像分析，不能获得关于代谢物空间分布的精确信息。这也在一定程度上限制了这类方法的应用范围。

    2.2 基于LDI的单细胞质谱分析方法

    LDI是一种利用特定能量的激光对样品进行解吸附和离子化的技术[26]。基质辅助激光解吸附离子化（Matrix-assisted laser desorption/ionization， MALDI）在LDI的基础上向样品中添加了辅助基质[27]。辅助基质可吸收和传递激光能量给样品分子，从而提高样品分子的离子化效率。同基于Nano-ESI的单细胞分析方法相比，基于LDI的方法可实现细胞代谢物的原位分析，无需借助三维机械臂进行繁琐的取样操作，使用过程较为简单。此外，LDI具有成像分析的优势，可获得代谢物空间分布的图像化信息。空间分辨率是成像分析的重要指标， 提高成像分辨率是LDI单细胞分析方法的重要研究内容。另外，LDI需要待测分子能够直接或者在基质的辅助下吸收激光的能量以实现离子化。因此，发展更高效率的基质材料，提高待测分子的离子化效率和检测灵敏度一直是LDI的重点研究内容。

    传统LDI的成像分辨率通常为5～50 μm[28]，难以进行亚细胞水平的成像分析。为获得更高的空间分辨率，Kompauer等[29]发展了一套基于新型紫外激光聚焦系统的MALDI成像分析系统。通过使用新型聚焦透镜，将紫外激光（337 nm）光斑直径缩小至1.4 μm。该成像系统使用了一种离子反射采集模式，即离子解吸附后飞行的方向与激光照射的方向相反（图4）。这样的离子采集模式可显著增加样品切片的自由工作距离。样品表面与聚焦物镜之间的距离可达18 mm。普通的MALDI成像光学系统只有不超过1 mm的自由工作距离。利用该系统，在亚细胞水平上实现了对大草履虫纤毛和口腔沟等不同部位代谢物的成像分析。

    Wang等[30]发展了一种基于真空紫外LDI的提高单细胞成像分辨率的方法。该方法使用了一种专门设计的光路系统，通过非球面MgF2透镜对紫外激光进行聚焦，所得光斑在样品表面单点剥蚀的直径可控制在～700 nm。 该成像系统显著提高了LDI的成像分辨率，通过改变激光强度，还可实现对不同分子和分子碎片的选择性检测，用于分子识别和定性分析。

    Yin等[31]提出了另一种基于近场激光解吸附技术（Near-field desorption postionization， NDPI）的提高LDI成像分辨率的方法。该方法首先利用原子力显微镜的表面形貌探测技术对样品的表面形貌进行解析，然后在近场条件下使用激光对样品表面进行解吸附（图5）。近场解吸附的方式显著缩小了光斑大小，突破了光学衍射极限，将成像的横向分辨率提高至350 nm。解吸附后，通过第二束激光对气化的样品分子进行二次离子化，提高离子化效率。通过添加辅助基质，将近场解吸附技术与MALDI离子化技术相结合，可进一步提高离子化效率和检测灵敏度。进一步将NDPI技术应用于药物成像分析研究，可在亚细胞水平实现两种吖啶类结构类似物药物（普罗黄素（Proflavine）和依沙吖啶（Ethacridine））的成像分析[32]。

    LDI的解吸附能力很强，但是离子化能力比较有限。Lee等[33]通过使用电喷雾（Electrospray ionization， ESI）辅助离子化，显著提高了LDI的离子化效率。该方法利用LDI对样品表面进行解吸附。同时将一束ESI喷雾射向LDI解吸附的区域。ESI产生的带电液滴携带着解吸附产生的待测分子向质谱进样口运动，完成电荷传递，实现待测分子的离子化。ESI强大的辅助离子化能力使得该技术对赖氨酸的检出限达到了2 amol。采用该技术实现了动物单细胞中多种代谢物组分的实时分析。

    MALDI通过添加基质的方式显著提高了LDI的离子化效率。发展新的辅助基质是基于MALDI的单细胞分析方法的重要研究内容。新基质的研发一方面可提高一些物质的离子化效率，从而提高检测灵敏度;另一方面可使一些原本难以离子化的物质实现离子化，拓展可检测物质的范围。α-氰基-4-羟基肉桂酸、2，5-二羟基苯甲酸和9-氨基吖啶是目前最常用的基质[29，34]。其它一些具有良好离子化效果的新基质也陆续被筛选出来，如3，4-二甲氧基肉桂酸[34]和1，1′-联萘-2，2′-二胺（1，1′-Binaphthyl-2，2′-diamine， BNDM）[35]等。此外，一些非有机小分子基质也能显著提高细胞代谢物的离子化效率，如氟化石墨烯纳米片层材料[36]和金纳米复合材料[37]等。

    Shanta等[38]发展了一种多功能金薄膜基底材料，实现了对单细胞的捕获和脂质化合物离子化效率的提升。该方法利用光刻蚀和電子束沉积技术在玻璃基底上铺设了一层金膜多孔阵列， 该阵列保证了较高的单细胞捕获率和离子化效率。捕获完成后，通过电沉积技术精确地向小孔中喷洒100 nL MALDI基质溶液。金膜阵列的使用，兼具表面增强荧光效应和MALDI离子化效率提升效果。利用该技术实现了对莱茵衣藻单细胞脂质成分的除草剂毒理学研究。

    Nie课题组采用了另一种提高待测分子检测灵敏度的思路，发展了一系列分子探针，利用共价键合的方式对单细胞中的待测分子进行标记[39，40]。标记后，通过LDI进行离子化， 分子探针在LDI的作用下与待测分子之间的共价键发生断裂，形成离子，进入质谱完成检测。该方法具有原位、高通量检测的优势。通过这种方式对不同细胞系单细胞表面的唾液酸复合物进行了定量分析，检出限可达5 fmol（图6）[39]。采用类似方式，进一步对细胞表面不同种类的多糖进行了表征和成像分析，利用细胞表面多糖种类和数量的变化研究细胞抗药性[40]。

    Wang等[41]发展了一种基于金纳米粒子的分子探针，实现了对细胞表面标志物的信号放大和高灵敏度检测。该方法首先在金纳米粒子表面标记上分子探针和抗体。通过表面带有特异性抗体的金膜芯片捕获待测细胞。借助抗原抗体反应，用标记好的金纳米粒子对细胞表面的标志物进行识别，将金纳米粒子标记在细胞表面。最后，通过LDI对分子探针进行直接解吸附离子化，完成检测。由于单个金纳米粒子上可标记多个分子探针，所以，同一个细胞表面的标志物可对应多个探针，从而显著放大检测信号，提高检测灵敏度。

    相比于Nano-ESI而言，LDI具有成像分析的优势。然而，由于存在光学衍射极限，LDI的成像分辨率普遍在μm级别。这样的空间分辨率对于体积较小的动物细胞而言略显不足。经过改进后，部分LDI成像系统的空间分辨率能够到达102 nm级别[30，31]。但这些装置系统在结构上较为复杂，实施难度较大。此外，LDI需要待测分子能够吸收所用波长激光的能量， 这在很大程度上限制了LDI检测对象的范畴。MALDI通过添加基质的方式对这一缺陷进行了一定程度的弥补， 基质的筛选和优化一直是需要考虑的问题。分子探针的使用可间接提高待测分子的检测灵敏度，但是分子探针的设计、合成和标记过程具有较大难度。

    2.3 基于SIMS的单细胞质谱分析法

    SIMS是一种具有高灵敏度和高空间分辨率的表面分析技术[42，43]。它使用高能一次离子束轰击样品表面，从样品表面溅射出带电的二次离子，实现样品表面待测组分的离子化。同LDI相比，SIMS的一次离子束没有光聚焦过程中的衍射问题，能够聚焦于更小的点。因此，SIMS具有更高的空间分辨率，可较容易地达到nm级别。此外，SIMS是目前唯一能够实现三维成像的质谱成像方法，在生命科学领域，尤其是单细胞成像分析方面有重要的应用价值[44]。然而，SIMS是一种较“硬”的离子源，高能量的一次离子束会产生许多碎片离子，导致对目标分子的分析变得困难。这使得SIMS在单细胞生物大分子的分析应用上受到了较大限制。发展更“软”的SIMS离子源，实现更大分子量细胞代谢物的高效离子化是基于SIMS的单细胞分析方法的重要研究方向。此外，高分辨和三维成像是SIMS的特色， 发展更高分辨率的二维和三维成像方法也是SIMS的前沿研究领域。

    Tian等[45]使用C+60离子束对氨苄西林（Ampicillin， AMP）和四环素（Tetracycline， TET）两种抗生素在大肠杆菌内的分布进行了亚细胞水平的成像分析。C+60的使用保证了AMP和TET在离子化过程中能够高效地产生分子离子，从而实现对二者的高灵敏度定性和定量分析。通过逐层剥蚀，实现了对大肠杆菌内两种抗生素的三维成像分析，横向分辨率达300 nm（图7），深度分辨率达200 nm。

    在前处理过程中，样品表面可能会沉积一些污染物，对检测信号带来影响。Leo等[46]利用C+60离子束对样品表面的污染物进行清理，采用25 keV Bi+3离子束对神经胶质细胞中的3种H2S合成酶进行了成像分析（图8）。结果表明，未经C+60离子束进行表面处理的样品无法获得可识别的成像图，几乎全为背景噪音;经过C+60离子束进行表面处理的样品可顺利获得细胞中H2S合成酶的成像图，成像分辨率达195 nm。成像结果与免疫印记分析和荧光共聚焦显微镜成像结果相吻合。

    气体团簇离子束（Gas cluster ion beams， GCIB）技术的出现和发展，如Ar+n和（CO2）+n [47，48]，使得SIMS在生物组织成像领域的应用研究得到了进一步拓展。这类离子束具有更为柔和的离子化过程，产生的离子碎片更少，能够实现更高分子量生物分子的离子化。

    Mohammadi等[49]用40 keV （CO2）+6000离子束对大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞（PC12）进行成像分析，研究了顺铂抗癌药物对PC12细胞新陈代谢过程的影响。结果显示，顺铂药物通过改变PC12细胞表面脂质组成对其胞吐行为及相关信号传导过程产生影响。Angerer等[50]使用40 keV （CO2）+4000离子束对Phagocata gracilis蠕虫体内的脂质分布进行了亚细胞水平的成像分析。 （CO2）+4000离子束同时产生了脂质分子的分子离子和碎片离子，可直接用于脂质分子的定性识别，无需进一步使用二级碎裂进行定性分析。

    Pareek等[51]使用70 keV （CO2）+n （n>10000）离子束对Hela细胞中的嘌呤合成代谢区室进行了3D成像分析（图9），空间分辨率达到了亚微米级别。结果表明，细胞内负责嘌呤合成的嘌呤体是由9种酶组成的复合体结构。嘌呤体通过控制嘌呤的合成调控嘌呤核苷酸的合成代谢，进而对相关代谢通路产生影响，调节细胞内单磷酸腺苷和单磷酸鸟苷的比值。该研究充分展现了GCIB-SIMS成像分析技术在复杂生物现象分析研究中的重要应用前景。

    Sheng等[52]将SIMS与稳定同位素标记技术相结合，实现了对蛋白质等生物大分子的高分辨二维和三维成像分析。使用含有15N-精氨酸和15N-赖氨酸的培养基对Hela细胞进行培养一段时间后，通过SIMS-TOF对细胞中15N标记的氨基酸和磷脂进行成像分析。该成像结果反映了细胞中新合成的蛋白质和磷脂的分布情况。在细胞分裂过程中，卵磷脂在分裂区具有较高浓度的分布，而新合成的蛋白质则较少分布在此区域。该方法对于一些细胞代谢行为及相关代谢产物分布的研究具有借鉴意义。

    Huang等[53]在高通量单细胞样品制备技术上进行了探索，建立了一种快速、高效的单细胞分选（Single-cell patterning， SCP）样品制备方法。该方法将聚二甲基硅氧烷材料微加工技术与细胞离心捕获技术结合，实现了单细胞阵列的制备。细胞在阵列位点上的占有率>90%，其中，单细胞占有率>97%。将该细胞阵列制备方法与SIMS-TOF相结合，实现了单细胞样品的高通量制备和分析，并成功地应用于药物诱导的细胞凋亡早期表型变化研究。

    Hua等[54]使用SIMS-TOF的延迟提取离子模式对银纳米离子（AgNPs）处理过的细胞表面脂质变化过程进行了分析。延迟提取检测模式的使用使得SIMS-TOF可同时获得高质量分辨率和高空间分辨率[55]，并且消除了样品表面形貌变化对检测的影响[56]。研究表明，经过不同浓度AgNPs处理的细胞在表面脂质分布呈现明显的差别，主要包括胆固醇、甘油单酯和甘油二酯。其中，经过高浓度AgNPs处理的细胞，其表面胆固醇和甘油二酯倾向于分布在细胞周边的区域。该研究为纳米粒子和细胞的相互作用研究提供了参考。

    Liu等[57]将SIMS-TOF与共聚焦激光扫描显微成像技术联用，实现了单个癌细胞内有机钌复合物抗癌药物的成像分析。该方法将共聚焦显微成像的结果与质谱成像的结果相结合，对有机钌在细胞内的分布情况进行了双重定位，成像结果更准确可靠。成像结果表明，有机钌复合物主要聚集在细胞膜和细胞核内。该方法在有机金属药物研发和药理学研究上具有良好应用前景，可实现多种有机金属药物分子的成像分析。

    在单一成像技术的基础上，将不同显微成像技术所得到的图像进行融合解析，不仅可提高SIMS的成像分辨率，还可更加全面和深入了解许多物理、化学和生命活动过程。Vollnhals等[58]将SIMS的成像数据与具有更高空间分辨率的电子显微镜（Electron microscope， EM）成像数据进行了融合解析，考察了两种数据融合策略分别产生的融合效果。结果表明，使用EM数据锐化处理中较为常用的强度-色调-饱和度处理策略进行融合，容易产生严重的图像伪影;而拉普拉斯金字塔图像融合处理策略则可更好地解决图像融合中存在的产生严重伪影的问题，图像融合结果更为稳定可靠。

    Passarelli等[59]在3D SIMS成像技术的基础上，结合高分辨质谱，研制出一种用于生物医学成像的3D-OrbiSIMS质谱装置。该装置将SIMS的高空间分辨率三维成像功能与Orbitrap的高质量分辨率相结合，实现了亚细胞水平上内源和外源性细胞代谢物的可视化三维成像分析。在无机样品的成像分析中，可使用30 keV Bi+3離子束进行离子化，以保证更高的离子化效率和空间分辨率。对于生物样品的分析，可使用5～20 keV Ar+n（1000<n<10000）离子束进行离子化，以降低在离子化过程中对生物分子造成的碎裂。采用该仪器成功地实现了小鼠海马神经元细胞中神经递质γ-氨基丁酸、多巴胺和5-羟色胺等代谢物的成像分析。

    在质谱成像技术中，SIMS能够实现三维成像，并且具有出色 的空间分辨率， 这使得SIMS在单细胞成像分析上具有不可替代的地位。但是，SIMS的离子化过程仍然存在缺陷。SIM适于进行无机物和元素分析，但是生物分子，尤其是结构不稳定的生物分子，以及生物大分子的离子化一直未能取得突破性研究进展，Nano-ESI和LDI在该方面表现出较大优势。此外，SIMS的离子化过程需要在高真空条件下进行，使活体检测难以实施。

    3 总结与展望

    细胞生物学的不断发展对单细胞分析方法的检测性能提出了更多和更高的需求。在检测对象方面，单细胞多组学研究的不断深入，要求更多种类的化合物被检测到。在检测性能方面，更多低含量化合物的检测对分析方法的灵敏度、特异性和基质耐受性提出了更大挑战。为满足这些应用研究日益增长的检测需求，基于Nano-ESI、LDI和SIMS等的现有单细胞质谱分析方法正在不断改进和完善。目前，这些分析方法的发展呈现出以下趋势：

    （1）时空分辨 很多细胞生物学机理的阐释需要从空间上对代谢物的分布进行解析，需要从时间上对代谢物的变化进行监测。如代谢物在细胞中的合成部位及发挥作用部位。在不同的细胞周期内，该代谢物在相关部位的含量是否变化等，单纯单细胞水平的分析方法无法实现这些检测需求。目前，基于SIMS的成像分析方法在高空间分辨应用研究方面取得了一些阶段性进展。未来， 在时间分辨方面，单细胞质谱分析方法还有很大发展空间。

    （2）定量分析 单纯定性或半定量分析已经无法满足细胞生物学越发深入的研究需求。相关研究工作迫切需要获得目标代谢物的量化数据。目前，通过添加同位素内标等方式，研究者已实现了单细胞中一些代谢物的定量分析。未来，在定量分析的准确度和精密度方面，还需进一步发展。

    （3）组学研究 随着单细胞分析方法检测性能的不断提升，单细胞中所能检测到的物质种类不断增加。根据物质种类的不同，目前已形成了单细胞多组学研究的趋势，如蛋白质组学、多肽组学、糖组学、代谢组学和金属组学等。未来，各个组学的研究工作将不断深化，不仅局限于测量问题上，而是深入到细胞生物学的重大科学问题，解决基础科研和应用研究中的实际问题。

    近年来，单细胞质谱分析方法的研究取得较大进展。在本文重点讨论的研究工作之外，还有很多出色的方法技术。如微流控芯片技术，可在μm尺度的芯片上，完成样品的制备、反应、分离和离子化等操作，具有微型化、集成化以及所需试剂耗材量小的优点。相比其它单细胞前处理技术， 微流控芯片技术具有更高的通量，被认为是最具有发展前景的单细胞样品前处理技术[60]。此外，电感耦合等离子体质谱（Inductively coupled plasma mass spectrometry， ICP-MS）近年在单细胞分析上也有较多的应用[61]。该技术速度快，灵敏度高，样品制备和进样过程较为简单，在单细胞金属组学的研究工作中具有较大潜力。

    历经十几年的发展，单细胞质谱分析方法已经取得了较大进展，但面对细胞生物学和临床医学等研究的需求，单细胞质谱分析方法仍然有很多亟待解决的问题，这也正是该方法未来发展的方向。

    References

    1 Zenobi R. Science， 2013， 342（6163）： 1243259

    2 Neumann E K， Do T D， Comi T J， Sweedler J V. Angew. Chem. Int. Edit.， ?2019，? 58（28）： 9348-9364

    3 Tang X N， Huang Y M， Lei J L， Luo H， Zhu X. Cell Biosci.， ?2019，? 9： 53

    4 Twigger A J， Scheel C H. Development， 2017，? 144（17）： 3007-3011

    5 Rubakhin S S， Romanova E V， Nemes P， Sweedler J V. Nat. Methods，? 2011，? 8： S20-S29

    6 Wu L L， Sedgwick A C， Sun X L， Bull S D， He X P， James T D. Acc. Chem. Res.， ?2019，? 52（9）： 2582-2597

    7 Tang Y H， Ma Y Y， Yin J L， Lin W Y. Chem. Soc. Rev.， ?2019，? 48（15）： 4036-4048

    8 Ganesana M， Lee S T， Wang Y， Venton B J. Anal. Chem.， ?2017， ?89（1）： 314-341

    9 Nisavic M， Janjic G V， Hozic A， Petkovic M， Milcic M K， Vujcic Z， Cindric M. Metallomics， 2018，? 10： 587-594

    10 GAO Fang-Yuan， ZHANG Wei-Bing， GUAN Ya-Feng， ZHANG Yu-Kui. Sci. China Chem.， ?2014，? 44（7）： 1181-1194

    高方園， 张维冰， 关亚风， 张玉奎. 中国科学： 化学， 2014，? 44（7）： 1181-1194

    11 Fujii T， Matsuda S， Tejedor M L， Esaki T， Sakane I， Mizuno H， Tsuyama N， Masujima T. Nat. Protoc.， ?2015，? 10（9）： 1445-1456

    12 Zhang X C， Wei Z W， Gong X Y， Si X Y， Zhao Y Y， Yang C D， Zhang S C， Zhang X R. Sci. Rep.， ?2016，? 6： 24730

    13 Wang R H， Zhao H S， Zhang X C， Zhao X， Song Z， Ouyang J. Anal. Chem.， ?2019，? 91（5）： 3667-3674

    14 Feng J X， Zhang X C， Huang L， Yao H， Yang C D， Ma X X， Zhang S C， Zhang X R. Anal. Chem.， ?2019，? 91（9）： 5613-5620

    15 Liu R M， Pan N， Zhu Y L， Yang Z B. Anal. Chem.， ?2018，? 90（18）： 11078-11085

    16 Zhu Y L， Liu R M， Yang Z B. Anal. Chim. Acta， 2019，? 1084： 53-59

    17 Yin R C， Prabhakaran V， Laskin J. Anal. Chem.， ?2018，? 90（13）： 7937-7945

    18 Cahill J F， Riba J， Kertesz V. Anal. Chem.， ?2019，? 91（9）： 6118-6126

    19 Kawai T， Ota N， Okada K， Imasato A， Owa Y， Morita M， Tada M， Tanaka Y. Anal. Chem.， ?2019，? 91（16）： 10564-10572

    20 Cong Y Z， Liang Y R， Motamedchaboki K， Huguet R， Truong T， Zhao R， Shen Y F， Lopez-Ferrer D， Zhu Y， Kelly R T. Anal. Chem.， ?2020，? 92（3）： 2665-2671

    21 Zhu Y， Piehowski P D， Zhao R， Chen J， Shen Y， Moore R J， Shukla A K， Petyuk V A， Campbell-Thompson M， Mathews C E， Smith R D， Qian W J， Kelly R T. Nat. Commun.， ?2018，? 9（1）： 882

    22 Huang G M， Li G T， Cooks R G. Angew. Chem. Int. Edit.， ?2011，? 50（42）： 9907-9910

    23 Zhu H Y， Zou G C， Wang N， Zhuang M H， Xiong W， Huang G M. Proc. Natl. Acad. Sci. USA， 2017，? 114（10）： 2586-2591

    24 Zhu H Y， Wang N， Yao L， Chen Q， Zhang R， Qian J C， Hou Y W， Guo W W， Fan S J， Liu S L， Zhao Q Y， Du F， Zuo X， Guo Y J， Xu Y， Li J L， Xue T， Zhong K， Song X Y， Huang G M， Xiong W. Cell， 2018，? 173（7）： 1716-1727

    25 Zhang X C， Zang Q C， Zhao H S， Ma X X， Pan X Y， Feng J X， Zhang S C， Zhang R P， Abliz Z， Zhang X R. Anal. Chem.， ?2018，? 90（16）： 9897-9903

    26 Bergman N， Shevchenko D， Bergquist J. Anal. Bioanal. Chem.， ?2014，? 406（1）： 49-61

    27 Hillenkamp F， Karas M， Beavis R C， Chait B T. Anal. Chem.， ?1991，? 63（24）： 1193A-1203A

    28 Yin L， Zhang Z， Liu Y Z， Gao Y， Gu J K. Analyst， 2019，? 144（3）： 824-845

    29 Kompauer M， Heiles S， Spengler B. Nat. Methods， 2017，? 14（1）： 90-96

    30 Wang J， Wang Z Y， Liu F， Cai L S， Pan J B， Li Z P， Zhang S C， Chen H Y， Zhang X R， Mo Y X. Anal. Chem.， ?2018，? 90（16）： 10009-10015

    31 Yin Z B， Cheng X L， Liu R， Li X P， Hang L， Hang W， Xu J Y， Yan X M， Li J F， Tian Z Q. Angew. Chem. Int. Edit.， ?2019，? 58（14）： 4541-4546

    32 Cheng X L， Yin Z B， Rong L， Hang W. Nano Res.， ?2020，? 13（3）： 745-751

    33 Lee J K， Jansson E T， Nam H G， Zare R N. Anal. Chem.， ?2016， ?88（10）： 5453-5461

    34 He H X， Qin L， Zhang Y W， Han M M， Li J M M， Liu Y Q， Qiu K D， Dai X Y， Li Y Y， Zeng M M， Guo H H， Zhou Y J， Wang X D. Anal. Chem.， ?2019，? 91： 2634-2643

    35 Sun C L， Liu W， Mu Y， Wang X. Talanta， 2020，? 209： 120557

    36 Sun J， Chen S M， Liu H H， Xiong C Q， Wang J Y， Xie X B， Xue J J， Chen P L， Nie Z X. RSC Adv.， ?2016，? 6（102）： 99714-99719

    37 Tseng Y T， Harroun S G， Wu C W， Mao J Y， Chang H T， Huang C C. Nanotheranostics， 2017，? 1（2）： 141-153

    38 Shanta P V， Li B C， Stuart D D， Cheng Q. Anal. Chem.， ?2020，? 92（9）： 6213-6217

    39 Sun J， Liu H H， Zhan L P， Xiong C Q， Huang X， Xue J J， Nie Z X. Anal. Chem.， ?2018，? 90（11）： 6397-6402

    40 Han J， Huang X， Liu H H， Wang J Y， Xiong C Q， Nie Z X. Chem. Sci.， ?2019，? 10（47）： 10958-10962

    41 Wang Y， Du R， Qiao L， Liu B. Chem. Commun.， ?2018，? 54（69）： 9659-9662

    42 Svatos A. Anal. Chem.， ?2011，? 83（13）： 5037-5044

    43 Lanni E J， Rubakhin S S， Sweedler J V. J. Proteomics， 2012，? 75（16）： 5036-5051

    44 Athwal H K， Lombaert I M A. Bio-Protocol， 2019，? 9（19）： UNSPe 3386

    45 Tian H， Six D A， Krucker T， Leeds J A， Winograd N. Anal. Chem.， ?2017， ?89（9）： 5050-5057

    46 Leo B F， Fearn S， Gonzalez-Cater D， Theodorou I， Ruenraroengsak P， Goode A E， McPhail D， Dexter D T， Shaffer M， Chung K F， Porter A E， Ryan M P. Anal. Chem.， ?2019，? 91（17）： 11098-11107

    47 Rabbani S， Barber A M， Fletcher J S， Lockyer N P， Vickerman J C. Anal. Chem.， ?2011，? 83（10）： 3793-3800

    48 Tian H， Maciazek D， Postawa Z， Garrison B J， Winograd N. J. Am. Soc. Mass Spectrom.， ?2016，? 27（9）： 1476-1482

    49 Mohammadi A S， Li X C， Ewing A G. Anal. Chem.， ?2018，? 90（14）： 8509-8516

    50 Angerer T B， Velickovic D， Nicora C D， Kyle J E， Graham D J， Anderton C， Gamble L J. Anal. Chem.， ?2019，? 91（23）： 15073-15080

    51 Pareek V， Tian H， Winograd N， Benkovic S J. Science， 2020，? 368（6488）： 283-290

    52 Sheng L F， Cai L S， Wang J， Li Z P， Mo Y X， Zhang S C， Xu J J， Zhang X R， Chen H Y. Int. J. Mass Spectrom.， ?2017，? 421： 238-244

    53 Huang L， Chen Y， Weng L T， Leung M， Xing X X， Fan Z Y， Wu H K. Anal. Chem.， ?2016，? 88（24）： 12196-12203

    54 Hua X， Li H W， Long Y T. Anal. Chem.， ?2018，? 90（2）： 1072-1076

    55 Vanbellingen Q P， Elie N， Eller M J， Della-Negra S， Touboul D， Brunelle A. Rapid Commun. Mass Spectrom.， ?2015，? 29（13）： 1187-1195

    56 Mihara I， Havelund R， Gilmore I S. Anal. Chem.， ?2017，? 89（9）： 4781-4785

    57 Liu S Y， Zheng W， Wu K， Lin Y， Jia F F， Zhang Y， Wang Z Y， Luo Q， Zhao Y， Wang F Y. Chem. Commun.， ?2017，? 53（29）： 4136-4139

    58 Vollnhals F， Audinot J N， Wirtz T， Mercier-Bonin M， Fourquaux I， Schroeppel B， Kraushaar U， Lev-Ram V， Ellisman M H， Eswara S. Anal. Chem.， ?2017，? 89（20）： 10702-10710

    59 Passarelli M K， Pirkl A， Moellers R， Grinfeld D， Kollmer F， Havelund R， Newman C F， Marshall P S， Arlinghaus H， Alexander M R， West A， Horning S， Niehuis E， Makarov A， Dollery C T， Gilmore I S. Nat. Methods， 2017，? 14（12）： 1175-1183

    60 Huang Q S， Mao S F， Khan M， Lin J M. Analyst， 2019，? 144（3）： 808-823

    61 Oomen P E， Aref M A， Kaya I， Phan N T N， Ewing A G. Anal. Chem.， ?2019，? 91（1）： 588-621

    Recent Advances in Single Cell Analysis Methods Based on Mass Spectrometry

    WANG Ju-Duo1，2， SONG Jia-Feng1， LI Chang2， DAI Xin-Hua2， FANG Xiang2，GONG Xiao-Yun*2， YE Zi-Hong*1

    1（College of Life Sciences， China Jiliang University， Hangzhou 310018， China）

    2（Center for Advanced Measurement Science， National Institute of Metrology， Beijing 100029， China）

    Abstract The heterogeneity among individual cells is of great importance for organisms to achieve different biological functions. Investigations deep into the mechanism of some biological phenomena rely on the analysis of the chemical compositions of single cells. Unfortunately， the successful analysis of single cells is technically difficult to achieve due to the complex composition of single cells， the very limited amount of materials in single cells and the huge difference among different metabolites in their concentrations. Mass spectrometry （MS） has been widely used in single cell analysis in recent years due to its high sensitivity， high specificity and capability for structure identification. Methods based on MS have been developed for the analysis of different metabolites in single cells. From the perspective of ionization techniques， there are mainly three single cell analysis methods， including nano-electrospray ionization （Nano-ESI） based method， laser desorption ionization （LDI） based method and secondary ion MS （SIMS） based method. This review summarizes the up-to-date developments of these methods and their future trends.

    Keywords Mass spectrometry; Single cell analysis; Ionization; Nano-electrospray ionization; Laser desorption ionization; Secondary ion mass spectrometry; Review

    （Received 12 March 2020; accepted 9 June 2020）

    This work was supported by the National Natural Science Foundation of China （Nos.21605135， 21927812）.

    2020-03-12收稿; 2020-06-09接受

    本文系國家自然科学基金项目（Nos. 21605135， 21927812）资助

    * E-mail： gxy@nim.ac.cn; zhye@cjlu.edu.cn