环二肽的研究进展

    魏贵香

    摘 ? ? ?要：环二肽是自然界中最简单的肽类衍生物，其通过两个氨基酸缩合形成。环二肽骨架是相对稳定的六元环结构并且有两个氢键供体和两个氢键受体，这使得环二肽能够与多种受体结合，表现出广泛的生理活性。对近年来环二肽的分布、化学合成以及生物合成途径进行了介绍。

    关 ?键 ?词：环二肽;分布;化学合成;生物合成

    中图分类号：TQ 041 ? ? ?文献标识码： A ? ? ?文章编号： 1671-0460（2020）02-0406-04

    Abstract： ?Cyclic dipeptide is the simplest peptide derivatives in nature that is formed by condensation of two amino acids. The cyclic dipeptide skeleton is a relatively stable six-membered ring structure with two hydrogen bond donors and two hydrogen bond receptors， which enables the cyclic dipeptide to bind to a variety of receptors and shows a wide range of physiological activities. In this article， the distribution， chemical synthesis and biosynthesis of cyclic dipeptides were briefly described.

    Key words： ?cyclic dipeptides; ?distribution; ?chemical synthesis; ?biosynthesis

    环二肽通过两个氨基酸酰胺内环化而成，母体为2，5-二酮哌嗪或2，5-二氧哌嗪，是已知的最小的、结构最简单的环肽（图1）。它的命名由每个氨基酸英文名字的前三个字母组成，加上一个表示绝对构型的前缀，如Cyclo（L-Xaa-L-Yaa）。在结构上，环二肽具有两个氢供体和氢受体，使其表现出较高的可激活酶或蛋白质特定结合位点的潜力，因而成为药物化学中重要的药效基团[1]。其稳定的六元环结构和刚性空间构象使其具有广泛的生理活性，这引起了许多学者的极大兴趣。此外，由于类似药物状和易被修饰的分子结构并可作药物分子设计中的药物分子片段，因此，环二肽在寻找蛋白作用受点和药物靶标方面具有重要的意义。

    1 环二肽在自然界中的分布

    环二肽类化合物种类繁多且来源广泛，据统计其90%由革兰氏阴性菌产生[2]， 它们也分离自革兰氏阳性菌、真菌、植物和动物[3]。Curtius等在1888年首次合成了第一种环二肽Cyclo（Gly-Gly）[4]。在以后的十多年里，许多诸如Cyclo（Gly-Gly）的简单的环二肽逐渐被合成或者从蛋白质及多肽水解产物、微生物、动植物中发现，但其唯一的目的是探索它们有趣的物理化学性质[5]。直到20世纪早期[6-8]，它特殊的生物学功能才开始引起研究学者的广泛关注，随着对环二肽研究的重视，其价值逐渐被发现。迄今为止，从海洋和陆地的曲霉、青霉等生态系统的真菌中分离到大量的环二肽及其相关化合物。1960年陈等从真菌病原褐座坚壳菌Rosellinianecatrix中分离得到Cyclo （L-Pro-L-Leu），该化合物对乳腺癌、宫颈癌和结肠癌有不同的抑制作用，同时还有免疫活性、调节激素及调控能量代谢的作用[9]。近年来，也从真菌中分离出许多环二肽类化合物，例如，2014年从海洋真菌Neosartoryapseudofischeri中分離到两种新的环二肽，neosartins A和neosartins B，以及六种已知的环二肽[10];2016年从海绵相关真菌Neossatoryaglabra中发现了一种新的fellutanine A的类似物[11];2017年从恒山黄芪内生真菌 Aspergillus sp. 中分离出对前列腺癌有较强抑制作用的Cyclo（L-Phe-L-Ala）[12];2018年邱玲等从冬虫夏草中分离出Cyclo（L-Pro-L-IIe）和Cyclo （L-Pro-L-Val）[13]。

    环二肽也从许多细菌中被发现，例如从海洋芽孢杆菌的培养液中，分离到两种新的环二肽衍生物，cyclo （L-Pro-L-Tyr）和cyclo （L-Pro-L-Val）[14]，从Oscheius属的病原线虫中提取的芽孢杆菌提取液中，分离得到具有抑制花生曲霉菌种能力的Cyclo（L-Pro-L-Met）、Cyclo（D-Pro–L-Phe）、Cyclo（L -Pro-L-Phe）、Cyclo（L-Pro-D-Tyr）和Cyclo （D-Pro-L- Tyr）[15]，从北极海洋细菌Pseudoalteromonas sp.分离出对番茄专化型尖孢镰孢有较强抑制作用的Cyclo（L-Pro-L-Tyr）[16]。同样，从也从苏云金杆菌、内生菌[17]等细菌中分离出结构丰富的环二肽。此外有一种古细菌（伊斯巴尼亚盐陆生菌）也产生环二肽[18]。

    活性较好的环二肽通常存在于人和动物体内。例如Cyclo（His-Pro）是第一个由下丘脑促甲状腺激素释放激素的氨基端焦谷氨酸残基水解的内源性环二肽，它普遍存在于人和动物体的中枢神经系统、体液及组织中，并且是与神经保护密切相关的有机阳离子转运蛋白的关键底物。与传统的不能治疗神经炎症的抗炎疗法相比，它可以穿过血脑屏障进入大脑中通过调节Nrf2/NF-κB信号通路介导不同的炎症和应激反应[19]。作为一种血脑屏障渗透性药物，Cyclo（His-Pro） 可以通过肠外和口服途径给药，从而可提高患者的依从性。实验表明，Cyclo（His-Pro） 也可通过Nrf2/HO-1途径抑制百草枯在大鼠嗜铬细胞瘤PC12细胞中诱导的NF-κB核积累[20]。此外，Cyclo（His-Pro）还具有一定的抗酒精麻醉[21]、抗糖尿病[22]、预防肥胖[23]等作用。蚂蚁Pachycondy- laapicalis分泌的Cyclo（ Leu-Phe）可作为自卫或进攻的工具[24]。

    除了在真菌、细菌和动物中发现的大量环二肽之外，还在植物中发现了许多简单的环二肽，例如马齿苋的地上部分，五味子的果实，掌叶半夏的块茎、麦冬的块根[25]以及南方灵芝子实体[26]中都发现了多种结构简单的环二肽（图1）。

    2 ?环二肽的合成方法

    环二肽是一种二聚体，代表了一个常见的自然发生的结构基序。如前所述，具有不同生物活性的环二肽通常从不同生物体中分离，在寡肽合成过程中，它们也经常被作为不需要的副产物或降解产物[27]。目前，合成环二肽的方法主要分为以下两种：

    2.1 ?化学合成法

    制备环二肽最简单的方法就是将游离的氨基酸甲酯密封加热，但是通常前体需要被保护。二肽酯（存在良好的离去基团）是最古老的合成不对称环二肽的原料[28]。目前存在很多环肽合成的方法，固相合成法是目前应用最广泛的方法，其中树脂类型、保护基团和裂解类型各不相同，常用的树脂有MBHA，Oxime和PAM 等。树脂上的活性基团是形成肽链的关键，活性基团通常为活性氨基，硫醇基，羟基，氯甲基等。正确选择保护基是其成功的关键，常用的保护基为Boc，t-Bu，Fmoc（暂时保护基），Bzl（永久保护基），Tos（侧链保护基）。合成过程：首先将氨基酸羧基末端通过苯基酯（O-Pac）等共价键与树脂结合，连接在树脂上的氨基酸的氨基保护基去保护后，与下一个氨基酸的羧基缩合偶联产生二肽，随后羧基和氨基保护基去保护，在缩合剂的缩合下形成环二肽骨架，最后将合成的环二肽从树脂上脱落下来。由于该方法是在树脂上环化然后分离，避免了分子间的二聚化和多聚化，因此利用该方法合成的环二肽具有较高的产率[29]。

    溶液合成法是合成环二肽的经典方法，线性肽成环是分子内的反应，为了避免分子间反应生成的线性或者环状的二聚化和多聚化，一般它需要在高度稀释的溶液（10-3～10-4 mol/L）中将游离的线性肽在缩合试剂的缩合下首尾连接成环，或先将其一端（通常为C端）活化再成环。将C端活化成环通常所采用的方法有硫酯法、活泼酯法、辅助成环法和叠氮法等。PAR-2受体激动剂7就是一种通过经典的溶液合成与微波加热相结合的方法合成的对称的环二肽，该方法避免了氨基酸α-位的差向异构化[30]。

    2.2 ?生物合成法

    虽然近年来新分离的天然环二肽的数量有所增加，但这些分子的生物合成途径在很大程度上仍然存在未知的，而天然产物生物合成的研究是发现化学结构及生物活性多样性的极为有效的途径之一。目前已阐明了几种环二肽的生物合成途径，一般可分为非酶合成途径和酶合成途径[31]。

    2.2.1 ?非酶合成途径

    非酶合成途径是指不需酶的参与肽链自身发生环化。上述提到的内源性环二肽Cyclo（His-Pro），在中枢神经系统中，具有多种生物活性。它由促甲状腺素释放激素（TRH， pGlu-His-Pro）的前体衍生而来。TRH前体为TRH-Gly （pGlu-His-Pro- Gly），首先被焦谷氨酸氨基肽酶裂解，生成His-Pro-Gly，然后非酶促环化生成Cyclo（His-Pro）。脯氨酸中吡咯环的存在增强了结构的刚性约束，这促进了组氨酸和脯氨酸之间肽键的顺式构象，有利于环二肽骨架的生成[32]。

    2.2.2 ?酶合成途径

    目前研究发现存在两种不相关的酶催化环二肽的形成，这两种酶分别是非核糖体肽合成酶（GRPSs）和环二肽合酶（CDPSs）。

    （1）GRPSs途径合成环二肽：目前所发现的环二肽骨架大部分是由GRPSs催化合成的。对于决定某个肽的NRPS基因，在原核生物中通常由一个操纵子组成，在真核生物中则以基因簇的形式存在[33]。GRPSs是目前發现的比较大的多功能酶系，由一系列按特定的空间顺序排列的模块组成，每个模块具有一组独特的、负责肽合成过程中特定合成步骤的催化结构域[34]。通常NRPSs由三个必要的结构域组成：腺苷酸化（A）结构域、肽酰载体蛋白（PCP）结构域和缩合（C）结构域。A结构域选择、活化并加载氨基酸进入PCP域以形成氨酰-S-载体复合物，携带氨酰基和肽酰基的载体（第一个肽键是带有两个氨酰基的载体）结合在C结构域上的特定区域，氨酰-S-载体复合物上的氨基作为亲核试剂向进攻肽酰-S-载体复合物肽酰基的酰基，从而形成新的肽酰-S-载体复合物。NRPSs的另一个重要催化单元是硫酯酶（TE）结构域，其作用是通过水解或大环化终止延伸并促进肽从PCP上的解离[35]。形成的新的线性肽酰-S-载体复合物与TE结构域结合以形成肽-O-TE的中间体，随后该中间体被TE结构域水解释放或经分子内环化形成环二肽类化合物。NRPSs除含有以上核心模块外，环二肽骨架可由其他结构域进行进一步的结构修饰，如差向异构（E）和N-甲基化结构域（M）进一步修饰分别合成了Erythrochelin[36]和Cyclomarazines[37]。NRPSs的底物非常广泛，除了把20种典型氨基酸作为底物外，还能催化安息香酸、4-硝基色氨酸分别合成Acetylaszonalenin和Thaxtomin[38]，NRPSs的底物多样性有利于非核糖体肽的结构和功能的多样性。

    （2）CDPSs途径合成环二肽：CDPSs是一类把氨酰-tRNA （aa-tRNA）作为底物的酶，它不需要激活NRPSs途径中A结构域氨基酸，能够利用现成的aa-tRNA合成环二肽类化合物。目前已经有较深研究的CDPSs共有三个：Albc、Rv2275、YvmC-Blic，它们的蛋白质晶体结构含有与氨基酸-tRNA合成酶（I型aa-tRSs）类似的Rossmann折叠和CP1[39]，与I型aa-tRSs不同的是CDPSs不存在与ATP结合相关的模体，也没有明显的tRNA结合域而是含有大量可与aa-tRNA底物相结合的带正电的氨基酸序列，结构独特性允许CDPSs直接利用aa-tRNA作为底物合成环二肽。研究表明，可能的催化机制为：将2分子在核糖体蛋白合成中起重要作用的aa-tRNA作为底物，通过连续的乒乓反应催化合成环二肽[40]。其催化过程大致可分为以下三步：

    ①CDPSs结合口袋上的Ser的羟基对第一个aa-tRNA进行亲核进攻，然后在Tyr和Glu的作用下将氨基酸与CDPSs结合并使tRNA释放，形成氨酰-CDPSs中间体;

    ②氨酰-CDPSs结合第二个aa-tRNA，与口袋中的第一个氨基酸缩合形成肽键，再次释放tRNA，形成二肽-CDPSs中间体;

    ③二肽-CDPSs中间体经分子内催化形成环二肽骨架[41]。形成的环二肽骨架经过与CDPSs相连的后修饰酶的修饰后最终形成结构及功能多样性的环二肽衍生物。

    3 ?结论

    作为肽类化合物中最具特征的化合物之一，环二肽类化合物由于其刚性的空间构象，结构多样性，可用于药物开发。然而，就目前的情况而言，人类对环二肽的结构、来源、它们的生物学意义及药理活性的理解并不全面，并且还没有就药用价值方面形成相对完整的系统，对此类化合物的研究还处于早期阶段，要充分了解它们在自然界中的具体作用并被人们所使用，还有很长的路要走。随着基因工程、化学酶法和组合生物合成等技术的发展，相信该类化合物很快会在临床药学、生物农药等行业发挥不可取代的作用。

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