苦参碱联用顺铂对HepG2肝癌细胞荷瘤裸鼠的增效减毒作用研究

    黎明吉 周喜汉 杨焕珍 黄思玲

    

    

    【摘要】 目的 探討苦参碱联用顺铂对HepG2肝癌细胞荷瘤裸鼠的增效减毒作用。

    方法 将HepG2肝癌细胞在裸鼠腋部皮下注射接种，构建出裸鼠皮下移植瘤实验动物模型。将25只瘤径≥5 mm雌性裸鼠（视为造模成功）完全随机划分成5组（每组5只）：正常对照组、顺铂组（DDP组，2 mg/kg）、低剂量苦参碱（25 mg/kg）+顺铂（2 mg/kg）组、中剂量苦参碱（50 mg/kg）+顺铂（2 mg/kg）组、高剂量苦参碱（100 mg/kg）+顺铂（2 mg/kg）组。裸鼠成瘤后药物干预14 d，取出瘤体，用千分电子秤称量瘤重，用公式计算抑瘤率。公式计算肾指数、肝指数、脾指数，检测肝、肾功能。

    结果 增效方面，各用药组与正常对照组相比瘤重量降低（P<0.05），各剂量苦参碱联用顺铂组与DDP组相比，瘤重量较小（P<0.05）。DDP组及低、中、高剂量苦参碱联用顺铂组抑瘤率依次为58.3%、76.7%、79.6%、82.1%。减毒方面，与DDP组相比，低剂量苦参碱+DDP组、高剂量苦参碱+DDP组血清胆碱酯酶增加（P<0.05）。DDP组较正常对照组BUN升高（P<0.05），低剂量苦参碱+DDP组BUN较DDP组增加（P<0.05），而中、高剂量苦参碱联用顺铂组BUN有回落趋势。低、中、高剂量苦参碱联用顺铂组的肾指数较单用顺铂组高（P<0.05）。

    结论 苦参碱与顺铂联用可提高抑瘤率，高剂量苦参碱对顺铂引起的肝损害、肾损害具有一定的缓解作用。

    【关键词】 苦参碱;不同剂量;顺铂;减毒;增效

    中图分类号：R735.7 ? 文献标志码：A ? DOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2021.05.003

    【Abstract】 Objective To investigate the synergism and attenuation effects of matrine （Ma） combined with cisplatin on tumor-bearing nude mice with HepG2 hepatoma cells.

    Methods HepG2 hepatoma cells were injected subcutaneously into the axillary region of nude mice to establish an experimental animal model of subcutaneous transplanted tumor in nude mice. A total of 25 female nude mice with tumor diameter ≥ 5mm （regarded as successful modeling） were randomly divided into the ?following 5 groups （5 mice in each group）： normal control group， cisplatin group （DDP group， 2 mg/kg）， low dose matrine （25 mg/kg） + cisplatin （2 mg/kg） group， medium dose matrine （50 mg/kg） + cisplatin group （2 mg/kg） group， and high dose ?matrine （100 mg/kg） + cisplatin （2 mg/kg） group. After 14 days of drug intervention， the tumor bodies were taken out， the tumor weight was weighed by thousandth electronic scale， and the tumor inhibition rate was calculated by formula. In addition， kidney index， liver index and spleen index were calculated by the formula to detect liver and kidney functions.

    Results In terms of synergism effect， the tumor mass of each drug group was significantly lower than that of the model group （P < 0.05）， and the tumor mass of each dose of matrine combined with cisplatin group was smaller than that of the DDP group （P < 0.05）. The tumor inhibition rates of the DDP group and the low， medium and high dose matrine combined with cisplatin groups were 58.3%， 76.7%， 79.6% and 82.1%， respectively. In terms of attenuation effect， compared with the DDP group， serum cholinesterase increased in the low dose matrine + DDP group and the high dose matrine + DDP group （P < 0.05）. Compared with the normal control group， the BUN of the DDP group increased （P < 0.05）， and the BUN of the low dose matrine + DDP group increased （P < 0.05）， while the BUN of the medium dose matrine + DDP group and the high dose matrine + DDP group showed a downward trend. The renal indexes of the low， medium and high matrine + DDP groups were higher than that of the DDP group （P < 0.05）.

    Conclusion Matrine combined with cisplatin can improve tumor inhibition rate， and high dose of matrine can alleviate liver and kidney damage caused by cisplatin to some extent.

    【Key words】 matrine; different doses; cisplatin; synergism; attenuation

    原发性肝癌（简称为肝癌）是全球癌症相关死亡的第三大主要原因，大部分患者在诊断时已属于肝癌晚期，预后差[1]。目前我国肝癌成为第4位（消化系统恶性肿瘤第2位）常见恶性肿瘤及第2位肿瘤致死病因，年龄调整发病率呈逐年下降趋势，但肝癌发病人数仍占全球的55%，肝癌所导致的疾病负担仍呈上升趋势，患者5年生存率无显著提高[2]。肝癌的发生可以将其归因于明确的风险因素（主要是慢性病毒性肝炎和酒精/非酒精性脂肪性肝炎）所导致的肝硬化[3]。目前肝癌的主要治疗手段仍以外科手术切除为主，辅以放化疗和靶向治疗等，近几年肝癌术后的联合化疗成为肝癌治疗的研究热点，其中中药在联合经典化疗药物（如铂类）治疗中的应用特别是其减毒增效作用是肝癌综合治疗的研究焦点，对改善患者生活质量，降低经典化療药物的毒副作用具有不可小觑的意义。苦参碱（Matrine，Ma）是传统中药苦参的主要药效成分之一，大量研究发现其具有抗肿瘤、抗炎、抗病毒、保肝和强心等作用。苦参碱可诱导恶性肿瘤细胞的凋亡，增强化疗药物的抗癌能力[4]。本研究选用肝癌细胞HepG2造模的4周龄雌性裸鼠进行试验，观察苦参碱对顺铂的增效减毒作用，为进一步深入研究提供实验依据。

    1 材料与方法

    1.1 材料

    1.1.1 细胞株

    人肝癌细胞株HepG2购自中国科学院，由右江民族医学院科学实验中心保存于液氮中。

    1.1.2 实验动物

    选用30只BALB/c-nu裸鼠（SPF级，雌性），4周龄，重量13～14 g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，饲养于右江民族医学院SPF级动物房内，裸鼠饮用水、饲料、垫料均经高温高压灭菌处理，所用物资来源于本校动物实验室。

    1.1.3 主要药品与试剂

    苦参碱：上海阿拉丁生化科技股份有限公司（批号：A1812039）;注射用顺铂（批号：国药准字H20023460）;Gemini南美胎牛血清，Solarbio 1×PBS（pH=7.3±0.1），Gibco DMEM高糖培养基、Solarbio胰蛋白酶消化液。丙氨酸氨基转移酶试剂盒（ALT，批号：45606501）、天门冬氨酸氨基转移酶试剂盒（AST，批号：45883101）、胆碱酯酶检测试剂盒（CHE2，批号：47270601）、尿素/尿素氮检测试剂盒（BUN，批号：49766601）、肌酐检测试剂盒（Cr，批号：49963101）均购自罗氏（Roche）诊断产品（上海）有限公司。

    1.1.4 主要仪器

    KDC-2046低速冷冻离心机（ZONKIA，安徽中科中佳科学仪器有限公司），全自动生化仪（cobas 8000，Roche），ME203电子天平[梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司]。

    1.2 方法

    1.2.1 细胞培养

    将本校提供的HepG2肝癌细胞株培养于含有10%胎牛血清的Gibco DMEM高糖培养基细胞培养液，放置在37℃、5%二氧化碳浓度及饱和湿度的恒温培养箱（型号MCO-18AIC）中培养;12～24 h后HepG2细胞贴壁生长于培养瓶底部培养基中，收集对数生长期（活力最佳）细胞用于实验。

    1.2.2 裸鼠肿瘤模型建立

    购买30只BALB/c-nu裸鼠（雌性，SPF级），严格饲养在恒湿（50%～55%）、恒温（20℃～27℃）、空气清洁层流、无特定病原体（specific pathogen free，SPF）的动物架上;饲养盒、空气过滤罩、动物饮用水、饲料等均经高温高压蒸气灭菌，2～3 d适时更换。于无菌检疫室饲养1周后，转移至SPF级小鼠房，碘伏消毒裸鼠腋下皮肤及周围，将对数生长期HepG2细胞注射至已消毒腋部皮下，细胞数量为1×107个（0.2 mL）。继续饲养已接种裸鼠，观察其腋部接种部位有无破溃、渗液，观察其精神状态、活跃性、饮食、排便。接种7～10 d后，可在其接种腋下皮肤触及米粒大小、质硬的结节，则为HepG2肝癌细胞荷瘤裸鼠造模成功。

    1.2.3 实验分组及处理

    从30只已造模雌性裸鼠中完全随机选取25只（瘤径≥5 mm），其余5只备用，将25只雌性裸鼠完全随机分成5组（每组5只）：正常对照组、顺铂组（DDP组，2 mg/kg）、低剂量苦参碱（25 mg/kg）+顺铂（2 mg/kg）组、中剂量苦参碱（50 mg/kg）+顺铂（2 mg/kg）组、高剂量苦参碱（100 mg/kg）+顺铂（2 mg/kg）组。分别腹腔注射：生理盐水、顺铂（2 mg/kg）、苦参碱（25 mg/kg）+顺铂（2 mg/kg）、苦参碱（50 mg/kg）+顺铂（2 mg/kg）、苦参碱（100 mg/kg）+顺铂（2 mg/kg），注射液体体积均为0.2 mL，隔天注射，共注射14 d。

    1.2.4 观察和测量

    观察荷瘤裸鼠腋部肿物变化及其精神状态、活跃性、饮食、排便。每次用药前测量裸鼠体重，用药14天后（隔天给药，共8次）眼球采集实验裸鼠血液标本，离心获得血清后检测肝肾功能，ALT、AST、BUN、Cr采用吸光度测量法测定，胆碱酯酶采用比色法测定;以上指标均采用全自动生化仪cobas 8000 检测，严格按试剂盒说明进行测定。取出瘤体，用千分电子秤称量瘤重，用公式计算抑瘤率;采集裸鼠脾脏称重，计算脾指数=（脾重量/每10 g裸鼠重）;采集裸鼠双肾称重，计算肾指数=（肾重量/每10 g裸鼠重）;采集裸鼠肝脏称重，计算肝指数=（肝重量/每10 g裸鼠重）。

    1.3 统计学方法

    用SPSS 22.0统计软件进行分析，以（±s）表示计量资料，组间比较采用单因素方差分析（ANOVA），多组间均数的两两比较采用q检验。α=0.05为检验水准，双侧检验。

    2 结 ?果

    2.1 增效方面

    各用药组与正常对照组相比瘤重量降低，差异有统计学意义（P<0.05），各剂量苦参碱联用顺铂组与DDP组相比，瘤重量更小，差异有统计学意义（P<0.05）。DDP组及低、中、高剂量苦参碱联用顺铂组抑瘤率依次为58.3%、76.7%、79.6%、82.1%。各用药组脾指数均下降，差异有统计学意义（P<0.001）。见表1。

    2.2 减毒方面

    2.2.1 对ALT、AST、胆碱酯酶及肝指数的影响

    与DDP组相比，低剂量苦参碱+顺铂组、高剂量苦参碱+顺铂组血清胆碱酯酶增加，差异有统计学意义（P0.05）。见表2。

    2.2.2 对BUN、Cr及肾指数的影响

    DDP组较正常对照组BUN升高（P<0.05）。低剂量苦参碱+顺铂组BUN较DDP组增加（P<0.05）。中剂量苦参碱+顺铂组、高剂量苦参碱+順铂组BUN较低剂量苦参碱+顺铂组减少（P<0.05），高剂量苦参碱+DDP组BUN较中剂量苦参碱+DDP组减少（P<0.05）。各剂量苦参碱联用顺铂组的肾指数均高于DDP组（P<0.05）。见表3。

    3 讨 ?论

    原发性肝癌的治疗领域是多学科、多种方法共同组成的。目前肝癌的治疗方法主要为肝肿瘤切除、肝脏移植、局部消融、TACE、放疗、药物治疗等[5]。尽管新兴的治疗手段如免疫治疗、溶瘤病毒等逐渐成为研究热点，但迄今为止，化学疗法仍是克服和根除癌症的理想选择[6]。顺铂是一种含铂金属基的抗癌药，其作用部位主要位于细胞DNA的嘧啶和嘌呤碱基，于1978年首次被批准用作抗肿瘤药，在当今许多形式的癌症中仍然是一种重要而有效的化疗药物[7]。临床上顺铂仍是针对各种类型的实体瘤如卵巢癌、睾丸癌、膀胱癌、肺癌、宫颈癌、食道癌、头颈癌的一线治疗[8]。虽然顺铂在多种实体瘤的治疗应用广泛，抗瘤效果显著，但其副作用和耐药性仍是不可忽视的两个固有挑战，这限制了顺铂的应用和有效性。为了使顺铂的副作用和耐药性减至最小，目前提倡使用联合疗法，并且已证明联合疗法对缺陷癌症更有效[9]。

    苦参碱是一种利用现代工业技术从传统中药苦参中分离提纯的生物碱。大量研究证明苦参碱具有抗癌作用，可以抑制癌细胞的增殖，阻滞细胞周期，诱导细胞凋亡，并抑制癌细胞的转移，同时还具有逆转抗癌药的耐药性并降低抗癌药毒性的作用[10]。本实验中，笔者以HepG2肝癌荷瘤裸鼠为模型，分别以单用顺铂、不同剂量苦参碱联合相同剂量顺铂，以瘤重、抑瘤率、脾指数作为增效观察指标，以裸鼠肝功能（ALT、AST、血清胆碱酯酶、肝指数）、肾功能（BUN、Cr、肾指数）、脾指数作为减毒观察指标进行实验。在增效方面，各用药组与正常对照组相比，瘤重均减少，低剂量苦参碱联用顺铂时抑瘤率比单用顺铂组增高，肿瘤抑制率随苦参碱浓度增高而上升，可知低剂量苦参碱即可明显提高单用顺铂化疗的抑瘤率，且苦参碱剂量越大，抑瘤率越高。脾脏是人体最大的外周淋巴器官，其富含各种淋巴细胞（B淋巴细胞约55%），同时拥有全身循环T淋巴细胞的25%，因此具有广泛的免疫功能，并在造血和红细胞清除中发挥作用[11]，可反映出机体免疫力的强弱。本实验发现，各用药组脾指数均下降，低、中、高剂量苦参碱对顺铂引起的脾脏缩小无明显改善，考虑可能与苦参碱对顺铂化疗引起免疫抑制的副作用改善效果不佳有关。血清胆碱酯酶是肝细胞合成的酶类之一，且由于其半衰期短，促使它成为一种极为敏感的肝损指标，可用于反映肝脏的合成功能，直接协助对当前肝脏的储备功能的评估，长期观测还可用于肝病预后的评估。在减毒方面，各用药组ALT、AST、肝指数无明显差异;低、中、高剂量苦参碱联用顺铂组血清胆碱酯酶较单用顺铂组高，而高剂量苦参碱联用顺铂组的血清胆碱酯酶升高更为明显，从而可看出苦参碱能促进肝细胞的合成功能。顺铂的副作用常见为肾脏损害、消化道反应、免疫抑制、骨髓抑制、神经系统损害等，其中对肾脏的损害是限制其剂量的主要因素之一[7]。在减毒方面，各用药组肌酐无明显差异;单用顺铂组较正常对照组BUN升高，低剂量苦参碱联用顺铂组BUN较单用顺铂组增加，提示低剂量苦参碱可能加重顺铂对肾脏的损害，中、高剂量苦参碱联用顺铂组BUN有回落趋势，且随着苦参碱剂量增加，BUN回落更明显，可看出高剂量苦参碱可保护肾脏免受顺铂损害。肾指数可反映肾脏损害的严重程度，各剂量苦参碱联用顺铂组的肾指数均高于单用顺铂组，从而可看出苦参碱能减少顺铂对肾脏的损害。

    综上所述，苦参碱与顺铂联用可抑制瘤体生长，提高抑瘤率，促进肝脏合成功能，增强机体对抗化疗药物的肝脏损害，高剂量时可减轻顺铂对肾脏损害。本研究为Ma在肿瘤化疗中增效减毒的作用提供了科学依据。

    参 考 文 献

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    （收稿日期：2021-02-05 修回日期：2020-04-13）

    （編辑：潘明志）