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标题 百事乐胶囊对慢性应激抑郁大鼠海马磷脂酰肌醇—3激酶信号通路相关因子的影响
范文 孟盼 杜青 张秀丽 柳卓 向韵 刘林 王宇红


摘要：目的 观察百事乐胶囊对慢性轻度不可预见性应激（CUMS）大鼠海马磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）信号通路关键因子表达的影响，探讨其抗抑郁的作用机制。方法 将SD大鼠随机分为空白组、模型组、氟西汀组和百事乐胶囊高、中、低剂量组，每组10只。采用CUMS加孤养的方式建立抑郁模型，造模同时灌胃给药，连续21 d。采用新奇摄食实验和Open-field实验评价行为学变化，ELISA检测血清单胺神经递质，免疫荧光和Western blot检测大鼠海马PI3K、蛋白激酶B（AKT）、血清糖皮质激素调节蛋白激酶1（SGK1）表达。结果 与空白组比较，模型组大鼠摄食潜伏期显著延长，水平和垂直活动次数明显减少（P<0.01），血清单胺神经递质含量下降（P<0.01），海马PI3K、AKT表达显著降低且SGK1表达显著升高（P<0.05，P<0.01）；与模型组比较，百事乐胶囊高、中剂量组大鼠摄食潜伏期显著缩短（P<0.05），水平和垂直活动次数显著增加（P<0.01），血清单胺神经递质含量显著升高（P<0.05，P<0.01），海马PI3K、AKT显著增加且SGK1表达显著降低（P<0.05，P<0.01）。结论 百事乐胶囊可通过缓解模型大鼠抑郁样行为，调控海马PI3K信号通路关键因子，发挥其抗抑郁的功效。
关键词：百事乐胶囊；抑郁症；海马；磷脂酰肌醇-3激酶；蛋白激酶B；血清糖皮质激素调节蛋白激酶1；单胺神经递质；大鼠
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.08.010
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2017）08-0041-05
Effects of Baishile Capsules on Hippocampal PI3K Signaling Pathway in Chronic Mild Unpredictable Stress Rats MENG Pan1， DU Qing1， ZHANG Xiu-li1， LIU Zhuo1， XIANG Yun1， LIU Lin2， WANG Yu-hong1，2 （1. Training Bases of Hunan Key Laboratory of Chinese Materia Medica Powder and Innovative Drugs Established by Provincial and Ministry， Changsha 410208， China； 2. First Hospital of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha 410007， China）
Abstract： Objective To observe the effects of Baishile Capsules on the hippocampal PI3K signaling pathway in chronic mild unpredictable stress （CUMS） rats； To discuss its mechanism of action for anti-depression. Methods SD rats were randomly divided into 6 groups， control group， model group， fluoxetine group， Baishile Capsules high-， medium- and low-dose groups， with 10 rats in each group. The cums depression model was established， and gavage for medication was conducted at the same time for 21 days in a row. The behavioral changes of rats in each group were detected by the novel feeding experiment and Open-field experiment； monoamine neurotransmitter in serum were detected by ELISA； the expressions of PI3K， AKT and SGK1 in rat hippocampus were detected by immunofluorescence and Western blot test. Results Compared with the control group， feeding latency of rats in model
基金項目：国家自然科学基金青年基金（81403387）；湖南省教育厅一般项目（14C0862）；中医内科学省部共建教育部重点实验室开放基金（ZYNK201503）；湖南中医药大学校级青年基金（99820001-147）
通讯作者：王宇红，E-mail：wyh107@126.com
group was significantly prolonged （P<0.01）， horizontal and vertical activities were significantly reduced （P<0.01）； the content of serum monoamine neurotransmitter decreased （P<0.01）； the expressions of PI3K and AKT in hippocampus decreased， while the expression of SGK1 increased （P<0.01， P<0.05）. Compared with the model group， Baishile Capsule high- and medium-dose groups can significantly shorten the incubation period of feeding rats （P<0.05）， and increase the number of horizontal and vertical activities （P<0.01）； the 5-HT and NE levels in serum were significantly elevated （P<0.05， P<0.01）； the expressions of PI3K， AKT in hippocampal increased； the expression of SGK1 decreased （P<0.05， P<0.01）. Conclusion Baishile Capsules can alleviate the depression like behavior in rat models， and regulate key factors of hippocampal PI3K signaling pathway， so as to exert antidepressant effects.
Key words： Baishile Capsules； depression； hippocampus； PI3K； AKT； SGK1； rats
抑郁症是一种以思维迟缓、意志活动减退和认知功能损伤等为主要特征的精神障碍性疾病，具有高患病率、复发率及自杀率，已成为威胁人类身心健康的杀手。抑郁症的发病机制复杂，涉及单胺递质系统功能和下丘脑-垂体-肾上腺轴功能紊乱等多种假说，但目前公认的假说都以海马作为其发病的靶部位。磷脂酰肌醇-3激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）信号通路与抑郁症的发生和发展密切相关，其下游信号主要分为依赖于蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）的和非依赖于AKT的，可参与调节细胞的生长、发育、分化和存活。百事乐胶囊由贯叶连翘、姜黄、人参组成，是临床经验方。本课题组前期研究发现，其可有效降低海马神经元凋亡[1]，促进海马神经再生[2]，增加海马神经突触可塑性[3]，但具体作用机制还未明了。基于此，本实验以PI3K信号通路关键因子为切入点，采用百事乐胶囊对慢性轻度不可预见性应激（CUMS）大鼠进行干预，深入探究其发挥抗抑郁功效的作用机制。
1 实验材料
1.1 动物
SPF级雄性SD大鼠60只，鼠龄8周，体质量220～250 g，湖南斯莱科景达动物中心，动物许可证号SCXK（湘）2015-0003。饲养于室温（24±1）℃、湿度（55±10）%环境，明暗交替12 h/12 h，自由饮水摄食。
1.2 药物
百事乐胶囊，湖南省中医药研究院，批号20150414；氟西汀胶囊，礼来（苏州）制药有限公司，批号0722A。
1.3 主要试剂与仪器
去甲肾上腺素（NE）、5-羟色胺（5-HT）ELISA试剂盒，R&D;公司；兔抗大鼠PI3K、AKT、血清糖皮质激素调节蛋白激酶1（SGK1），英国Abcam公司；FITC荧光二抗，美国Proteintech公司；近红外荧光二抗Alexa Fluor?700，美国LI-COR Odyssey；即用型SABC液、正常山羊血清封闭液、RIPA裂解液、BCA蛋白定量试剂盒，北京中杉金桥生物技术有限公司，Protein Marker，美国MBI Fermentas公司。生物组织切片机（THERMO SCIENTIFIC），NC膜（美国Millipore公司），开野视频跟踪系统（Panlab），万分之一电子天平（日本岛津），超纯水仪（威立雅水务集团），正置荧光显微镜及图像分析系统（Cail Zeiss），近红外双色激光成像系统（美国LI-COR Odyssey）。
2 实验方法
2.1 分组和给药
所有大鼠适应性饲养3 d，按体质量随机分为空白组、模型组、氟西汀组（5.4 mg/kg）组和百事乐高、中、低剂量组（2.88、1.44、0.72 g/kg），每组10只。造模同时灌胃给药，給药体积10 mL/kg，空白组和模型组给予等量纯净水。每日1次，连续21 d。
2.2 造模
参照文献[2]方法，采用CUMS加孤笼饲养方法复制抑郁模型。空白组每笼饲养5只，不给予任何刺激；其余各组单笼饲养，每日随机给予不同刺激，共21 d，包括禁食24 h、禁水24 h、倾笼45 ℃、夹尾1 min、4 ℃冰浴15 min、昼夜颠倒24 h、噪音5 min，每日随机安排1种，平均每种刺激使用3次。
2.3 行为学检测
2.3.1 Open-field实验 第22日，各组大鼠进行行为学检测。大鼠从80 cm×80 cm×40 cm、底面均分为25个方格的黑色敞箱的角落放入，适应1 min后，拍摄并记录各组大鼠3 min内水平活动次数（四爪皆进入方可记1次），垂直活动次数（两爪腾空放下记1次），以水平和垂直活动次数作为评价其抑郁行为的指标。
2.3.2 新奇摄食实验 Open-field实验结束后，各组大鼠禁食不禁水，第23日放入微光环境通用隔音试验箱内，箱内中央放入事先称好的饲料，安静环境下使用动物行为采集监控系统观察并记录6 min，其中适应2 min，记录后4 min大鼠进入箱内首次开始接触并摄入饲料的时间（记为摄食潜伏期），以此作为实验动物在陌生环境下情绪变化的行为学评价指标。
2.4 ELISA检测血清单胺神经递质含量
第23日大鼠行为学测试结束后，大鼠腹腔注射10%水合氯醛（4 mL/kg）麻醉，腹主动脉取血，促凝管收集，3000 r/min离心10 min，血清放入1.5 mL离心管，-80 ℃保存，严格按照试剂盒说明书进行检测。
2.5 样本采集
行为学测试结束后，各组大鼠禁食不禁水24 h，腹腔注射10%水合氯醛（3 mL/kg）麻醉，仰位固定于手术台上，腹腔取血。每组取5只大鼠，快速剖开胸部使心脏暴露，用灌注穿刺针沿着心脏的纵轴方向经心尖部插入左心室至主动脉根部，立即快速灌入约4 ℃生理盐水250 mL，待流出的液体澄清后慢速灌注4%多聚甲醛溶液（4 ℃）至动物四肢僵硬后取出脑组织标本，固定于4%多聚甲醛24 h，75%、95%、100%梯度乙醇脱水，浸蜡，包埋，切片，备用。每组再取5只大鼠，采血后直接取全脑后分离双侧海马，液氮速冻，-80 ℃冰箱保存。
2.6 免疫荧光检测
切片常规脱蜡、冲洗，滴加封闭液，37 ℃孵育30 min，去除多余液体；分别加入PI3K、AKT、SGK1的一抗（1∶1000稀释），37 ℃温育30 min，4 ℃过夜。0.01 mol/L PBST漂洗5 min×3次；加FITC荧光标记的二抗，37 ℃湿盒避光孵育30 min。0.01 mol/L PBST避光漂洗5 min×3次；甘油缓冲液封片，采用ZEISS图像分析软件计算各组大鼠PI3K、AKT、SGK1免疫阳性细胞数。
2.7 Western blot检测
在冻存海马中加入组织裂解液，电动匀浆，离心，取上清液。BCA试剂盒测定蛋白浓度。配制15%浓缩胶与10%分离胶，上样，电泳（浓缩胶60 V、40 min，分离胶80 V、90 min）至溴酚兰到达凝胶底部即可。采用半干式转膜法将凝胶中的蛋白分子转移到NC膜上，封闭1 h，用TBST洗涤后加入相应的一抗，4 ℃孵育过夜。TBST洗涤3次后加入近红外荧光二抗（1∶1000），孵育0.5 h。采用近红外双色激光成像系统扫描，并进行数据分析。
3 统计学方法
采用SPSS 17.0统计软件进行分析，实验数据以—x±s表示，组间比较采用方差分析。P<0.05表示差异有统计学意义。
4 结果
4.1 Open-field实验结果
与空白组比较，模型组大鼠3 min内水平和垂直活动次数均显著降低（P<0.01）；与模型组比较，氟西汀组和百事乐高、中剂量组模型大鼠水平和垂直活动次数显著增加（P<0.05，P<0.01）。结果见表1。
（下同）
4.2 新奇摄食实验结果
与空白组比较，模型组大鼠摄食潜伏期显著延长（P<0.01）；与模型组比较，氟西汀组和百事乐高、中剂量组大鼠摄食潜伏期显著缩短（P<0.05，P<0.01）。结果见表2。
4.3 百事乐胶囊对模型大鼠单胺神经递质的影响
与空白组比较，模型组大鼠血清5-HT和NE含量显著降低（P<0.01）；与模型组比较，氟西汀组和百事乐高、中剂量组大鼠血清5-HT和NE含量显著升高（P<0.05，P<0.01）。结果见表3。
表3 各组大鼠血清神经递质含量比较（—x±s，ng/g）
4.4 免疫荧光检测结果
与空白组比较，模型组大鼠海马CA3区PI3K、AKT免疫阳性细胞数减少，SGK1免疫阳性细胞数增加（P<0.01）；与模型组比较，氟西汀组和百事乐高剂量組大鼠海马CA3区PI3K、AKT免疫阳性细胞数增加（P<0.05，P<0.01），SGK1免疫阳性细胞数减少（P<0.01），百事乐胶囊中剂量组PI3K免疫阳性细胞数增加（P<0.01），SGK1免疫阳性细胞数减少（P<0.05）。结果见表4、图1～图3。
4.5 Western blot检测结果
模型组较空白组大鼠海马PI3K、AKT表达明显降低，SGK1表达明显增加（P<0.01）；与模型组比较，氟西汀组和百事乐高剂量组大鼠海马PI3K、AKT表达明显增加，SGK1表达显著降低（P<0.05，P<0.01），百事乐中剂量组大鼠海马PI3K表达明显增加、SGK1表达明显降低（P<0.05）。结果见图4、表5。
5 讨论
目前，根据抑郁症发病机制各种假说开发的治疗抑郁症药物大多存在起效延迟、复发率高和不良反应大等现象。中药立足于整体，可调节机体的多系统、多环节、多靶点，对复杂的神经精神疾病有独特疗效。
本实验采用目前国际公认的新奇摄食实验和旷场实验对抑郁症动物模型进行行为学评价，发现模型组大鼠摄食潜伏期明显延长，水平和垂直活动次数减少，且血液学检测中发现血清单胺神经递质显著降低。百事乐各剂量组可显著缩短模型大鼠摄食潜伏期，增加其自主活动和血清单胺神经递质含量，提示百事乐胶囊可有效改善抑郁样症状。
P13K是一种胞内磷脂酰肌醇激酶，是生长因子受体家族信号转导过程中的重要成员，其下游依赖于AKT的信号通路即指AKT是P13K下游信号的靶蛋白，可参与胞内物质代谢，调节细胞的生长和凋亡[4]。非依赖于AKT的信号通路即指SGK1是PI3K的下游靶蛋白，其是不同于AKT的另一种PI3K下游靶点，可被PI3K激活后参与细胞存活的调节[5-6]。
PI3K-AKT信号通路是促进细胞生存和维持细胞正常功能的关键信息分子链[7]。在精神疾患中，PI3K-AKT信号通路受抑制，可使中枢神经元和海马干细胞功能下降，从而导致精神疾病的产生[8]。SGK1是PI3K下游不同于AKT的一种快速诱导型蛋白激酶，结构与AKT高度相似。SGK1作为皮质醇对神经发生和糖皮质激素受体功能变化的“调解者”，可参与胞内转运、神经兴奋等生理过程[9]。SGK1在慢性不可预测应激大鼠和慢性皮质酮诱导的抑郁样小鼠海马中的表达均显著增加[10-11]。本实验中，免疫荧光、Western blot结果发现，模型组大鼠海马PI3K、AKT表达降低，SGK1表达增加，而给予百事乐胶囊后，这些变化明显发生改变或逆转，尤以对PI3K/SGK1信号的调节更为显著。
综上，百事乐胶囊发挥抗抑郁功效的机制主要通过调节海马PI3K及其下游SGK1信号而实现。下一步拟采用化学阻断技术，分别从在体动物和离体原代神经元细胞不同层面探讨其对SGK1信号的作用机制及起效靶点。
参考文献：
[1] 韩远山，王宇红，孟盼，等.百事乐胶囊对抑郁模型大鼠海马神经元显微结构及凋亡的影响[J].时珍国医国药，2015，26（1）：44-47.
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[3] 王宇红，孟盼，蔡光先，等.百事乐胶囊对慢性应激抑郁模型大鼠行为学及海马突触素表达的影响[J].世界科学技术-中医药现代化，2013， 15（7）：1562-1568.
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[11] ZHANG K， PAN X， WANG F， et al. Baicalin promotes hippocampal neurogenesis via SGK1 and FKBP5 mediated glucocorticoid receptor phosphorylation in aneuroendocrine mouse model of anxiety/ depression[J]. Sci Rep，2016：30951-30958.
（收稿日期：2017-01-06）
（修回日期：2017-01-22；編辑：华强）
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更新时间：2025/6/23 11:53:55