表面增强拉曼光谱同时检测原烟中三唑醇和三唑酮残留

    李霞　陈晓水　黄艺伟　杨君　温宝英　周国俊　李剑锋

    

    

    

    摘 要 基于表面增强拉曼光谱（SERS）可在低浓度待测物质甚至是单分子水平上获得高灵敏度结构信息的优势，本研究提出并建立了一种结合便携式拉曼光谱仪，利用SERS实现原烟中广谱杀菌剂三唑醇和三唑酮残留同时快速检测的方法。采用酸性条件下的聚酰胺作为净化剂，以除去烟草中色素、酚类、有机酸类等的干扰影响，以纳米金溶胶作为SERS基底，通过三唑醇或三唑酮在金溶胶表面的吸附放大拉曼信号，实现高灵敏检测。结果表明，原烟中三唑醇、三唑酮残留量的检测灵敏度为1 mg/kg，检测时间为8～12 min。本研究建立的SERS检测方法操作简便、成本低、快速、准确，适用于烟草中三唑醇和三唑酮农药残留的快速检测。

    关键词 表面增强拉曼光谱; 烟草; 农药残留; 三唑醇; 三唑酮; 聚酰胺; 快速检测

    1 引 言

    三唑酮是一种高效、低毒、内吸性强的广谱三唑类杀菌剂，主要用于防治植物真菌病毒如锈病、白粉病等，在农业生产中使用非常广泛，登记作物包括烟草、小麦、水稻、玉米、花生、番茄、苹果树等。三唑醇为三唑酮的代谢产物，其杀菌活性高于三唑酮，已被作为单独药剂在多种作物上登记使用。研究表明，三唑酮及三唑醇会产生神经、生殖和基因毒性，并具有致癌和致畸效应[1，2]。为保证两种农药的科学合理使用，很多国家已明确限定了三唑酮和三唑醇在食品及农作物中的最高残留限量，中国烟草总公司发布了其在烟叶中的最大残留限量标准[3]。因此，对三唑酮和三唑醇残留量的快速检测具有重要意义。

    目前，烟草及烟草制品中三唑酮和三唑醇的检测方法主要有气相色谱法（GC）、气相色谱-质谱联用法（GC-MS）[4]、高效液相色谱法（HPLC）、高效液相色谱-质谱联用法（HPLC-MS） [5，6]及酶联免疫分析法（ELISA） [7]等。色谱法具有准确性好、灵敏度高、可同时测定多种农药残留等优势，但所需仪器设备昂贵，且样品前处理复杂、检测时间长，不适用于大批量样品的快速筛查。酶联免疫分析法相对于传统仪器分析技术具有快速、简便等优势，但在获得高效价和高特异性的抗体，以及提高方法检测灵敏度方面，仍有待进一步改进和提高。

    表面增强拉曼光谱技术（SERS）是一种非常有效的探测分子间相互作用、表征表面分子吸附行为和分子结构的工具，具有检测灵敏度高、样品前处理简单、分析速度快、检测成本低、可实现实时原位检测等优点，已被用于食品和农产品中食用添加剂、农药残留等的快速检测[8～10]。Shende等[11]利用固相萃取结合SERS技术，检测橙汁中甲基毒死蜱，最低检出浓度可达到50 μg/kg。黄双根等[12]采用SERS结合化学计量学的方法， 对小白菜中单一农药西维因进行快速定量检测，最低检测浓度低于0.976mg/L。Li等[13]应用SERS技术检测苹果表皮中的甲拌磷和倍硫磷，甲拌磷的检测限为0.05 mg/L，倍硫磷的检测限为0.4 mg/L。近年来，有关SERS检测农药的相关研究报道日趋增多，如朱晓宇等[14]利用SERS技术对绿茶中毒死蜱农药残留进行了定量检测，相关性可以达到0.9863，检测限可达0.56 mg/kg，同时单个样本的检测可在15 min内完成; 杨永安等[15]利用SERS技术对菜籽油中乐果农药残留进行了检测，检测限可达到0.1 mg/kg。上述研究结果表明，SERS技术在农药残留的现场快速检测方面显出了良好的应用价值。

    然而，由于烟草实际样品复杂，前处理困难且时间长，因此SERS技术在烟草农残检测中的应用难度较大，利用SERS技术检测烟草中的农药残留的文献报道很少。此外，在生物体内，三唑酮分子中的羰基极易被还原成羟基，生成三唑醇[16]。因此，同时对三唑酮和三唑醇进行检测显得尤为重要。目前，大部分农产品中农药残留的SERS检测报道均为单标检测，同时对两种或者两种以上的农药残留直接检测的研究未见报道。

    基于此，本研究发展了一种结合前处理技术，使用便携式拉曼光谱仪对原烟样品中的三唑醇和三唑酮进行快速检测的方法。首先，建立一种快速简便的提取原烟中三唑醇和三唑酮的方法，采用纳米金溶胶作为SERS基底，使三唑醇或三唑酮农药吸附于金溶胶表面，从而实现其拉曼信号的放大，最终实现三唑醇与三唑酮的高灵敏同时检测，整个检测在10 min内完成。本方法具有灵敏度高、耗时短、操作简便等优点，为烟草及烟草制品中农药残留的快速检测提供了新思路。

    2 实验部分

    2.1 仪器与试剂

    SPEC-VKR785便携式拉曼光谱仪（厦门斯贝克科技有限责任公司，激发光波长785 nm，最大激光功率为500 mW）; smart-N系列超纯水仪（上海力康国际贸易有限公司，）; H2500R高速离心机（湖南湘仪实验仪器开发有限公司）; XH-C漩涡振荡器（江苏天翊仪器有限公司）。

    三唑醇（96%，异构体混合物）、三唑酮（99.8%）、聚酰胺（100～200目）购于阿拉丁化学试剂有限公司; 石油醚（分析纯）、Na2SO4（分析纯）购于国药集团化学试剂公司; 纳米金表面增强试剂购于厦门赛纳斯科技有限公司。

    2.2 三唑醇和三唑酮标准品的拉曼光谱采集

    分别将标准品三唑醇、三唑酮固体粉末置于干净的载玻片上，压平，于便携式拉曼光谱仪上进行拉曼光谱采集。

    分别配制不同浓度的三唑醇、三唑酮标准溶液（1、0.1、0.05和0.01 mg/L）。取200 μL标准液，加入50 μL团聚剂（1 mol/L Na2SO4-HCl（4∶1， V/V））和200 μL纳米金表面增强试剂，在785 nm激发光、激光功率500 mW、扫描时间10 s的条件下，采用便携式拉曼光谱仪采集拉曼光谱。

    2.3 原烟样品的前处理

    準确称取磨粉后的原烟样品（浙江中烟工业有限责任公司提供）1 g，加入10 mL水浸润，再加入8 mL石油醚，漩涡振荡，离心后，取上层液，依次加入净化剂0.2 g聚酰胺和100 μL HCl（1 mol/L），振荡，离心，收集有机层，吹干，加入500 μL水复溶，得到待测样品液。

    2.4 待测样品液的SERS检测

    取200 μL待测样品液于样品管中，加入50 μL团聚剂、200 μL纳米金表面增强试剂，混合均匀，在激发光源785 nm、功率500 mW、扫描时间10 s条件下，测定拉曼图谱。

    3 结果与讨论

    3.1 三唑醇和三唑酮标准品的SERS分析

    三唑醇和三唑酮标准品的拉曼光谱及其水溶液的SERS谱图如图1所示，在三唑醇的SERS谱中， 观察到536、632、745、862、983、1012、1091和1221 cm-1处的SERS峰。根据三唑醇的分子结构和拉曼峰位归属以及文献[17]报道可知，在745 cm-1 处的拉曼信号可归属于CO键的伸缩振动，在862 cm-1的峰为CNN和苯环的弯曲振动，在1091 cm-1处的拉曼峰可归属于三唑醇分子中六元环的平面内呼吸振动和CCl 键的伸缩振动。因此，在536、745、862和1091 cm-1处的特征峰可作为SERS光谱检测三唑醇的判别依据。

    类似的，三唑酮的SERS峰出现在589、641、830、987、1091和1221 cm-1处。其中，在589 cm-1 处的拉曼信号可归属于五元环的平面内呼吸振动，在641 cm-1处的拉曼信号可归属于五元环的变形振动，在830 cm-1 处的拉曼信号可归属于六元环的呼吸作用，信号最强的1091cm-1峰可归属于三唑酮分子中CCl 键伸缩振动和六元环的平面内呼吸振动。由于分子内振动产生的分子极性变化较大，导致极化率变化明显，信号较强[18，19]。因此，在589、641、830和1091 cm-1处的特征峰可作为SERS光谱检测三唑酮的判别依据。

    对比三唑醇和三唑酮SERS谱图时，发现部分拉曼特征峰的出峰位置重叠，如987、1091、1221和1590 cm-1，这是由于三唑醇和三唑酮结构十分相似，分子内化学键的振动方式也类似，因此，其所反映出的拉曼光谱峰位置也十分接近。但是，羟基和羰基的极性不同，靠近这两个官能团的化学键的振动能量不同，拉曼信号存在差别，如三唑醇在536 和862 cm-1的拉曼信号、三唑酮在589、641和830 cm-1的拉曼信号。因此，可以通过这些拉曼特征峰区分三唑醇与三唑酮。

    由三唑醇和三唑酮系列标准溶液的SERS光谱（图2）可进一步观察到，三唑醇和三唑酮的SERS谱中特征峰强度随标准溶液浓度（1、0.5、0.1、0.05和0.01 mg/L）而变化，且均在浓度低至0.05 mg/L时仍有明显的拉曼谱峰。上述结果表明，本方法对三唑醇、三唑酮标准溶液的检出浓度均可低至0.05 mg/L。

    3.2 原烟样品中三唑醇和三唑酮的检测

    受烟叶中色素、酚类、有机酸类等杂质的干扰，农药分子的拉曼信号被削弱，本研究采用酸性条件下的聚酰胺对原烟样品的提取液进行净化处理[20]，以去除杂质的干扰，并通过纳米金溶胶作为SERS基底进行检测。以磨粉后的原烟空白样品为对照，分别向其中添加农药标准品至浓度为0、 0.5、 1、 2、 3、 4和5 mg/kg，自然晾干后，进行样品前处理，并进行SERS检测，分别得到原烟样品中三唑醇和三唑酮的SERS光谱（图3A和图3B）。由于原烟样品成分复杂，提取农药的同时，也有其它物质被提取出来，导致原烟空白在994和1031 cm-1出现特征峰，但并未对到三唑醇和三唑酮特征峰产生干扰。由图3A可知，三唑醇的浓度为1 mg/kg时，745和1091 cm-1的特征峰仍能明显识别，当浓度低至0.5 mg/kg时，所得的SRES光谱与原烟空白的相似。实验结果表明，此检测方法对原烟中三唑醇农药残留的检出限低于1 mg/kg，重现较好，检出率>90%。

    由图3B可知，三唑酮的浓度为1 mg/kg时，589、641、830和1091 cm-1处的特征峰较弱，但仍能明显识别，当浓度低至0.5 mg/kg时，所得的SRES光谱与原烟空白谱图的相似。实验结果表明，本方法对原烟中三唑酮农药残留的检出限低于1 mg/kg，方法重现性良好。本方法检测三唑醇和三唑酮的检出限均低于标准[3]规定的最大限量值（5 mg/kg）。

    在植物体内，三唑酮分子中的羰基易被还原成羟基，生成三唑醇[16]。在原烟农药残留的实际检测过程中，三唑醇与三唑酮通常不是以单一农药的形式存在于煙叶中。

    因此，进一步考察了原烟中三唑醇与三唑酮同时存在时对检测的影响，实验结果如图4所示。分别在原烟中同时加入不同浓度的三唑醇与三唑酮，采用相同的处理方法对此烟叶样品进行检测，由图4的SERS谱图可知，当原烟样品中的三唑酮浓度比三唑醇浓度小时，三唑酮（589、641、830和1091 cm-1）和三唑醇（745和1091 cm-1）的特征峰都能明显观察到; 反之，当三唑酮的浓度比三唑醇浓度大时，两者之间的特征峰也互不干扰。由此可见，三唑醇和三唑酮二者拉曼谱峰互不干扰，可以实现对三唑醇和三唑酮的同时检测。

    4 结 论

    发展了一种使用便携式拉曼光谱仪，结合SERS技术同时快速检测原烟中三唑醇和三唑酮的方法。采用酸性条件下的聚酰胺作为净化剂，以除去烟草中色素、酚类、有机酸类等杂质的干扰影响，再通过纳米金溶胶作为SERS基底，使三唑醇或三唑酮农药吸附于金溶胶表面，从而实现其拉曼信号的放大与灵敏检测。烟叶中三唑醇、三唑酮残留量的检测灵敏度为1 mg/kg，检测时间为8～12 min。本研究为烟草中三唑醇和三唑酮的同时快速检测提供了一种新方法。

    References

    1 Menegola E， Broccia M L， Renzo F D， Massa V， Giavini E. Toxicol. in Vitro， 2005， 19（6）： 737-748

    2 LI Xiao-Dan， WANG Jian-Mei， WANG Xiang-Jun， YANG Hua， JI Xiao-Feng， XU Jie， QIAN Ming-Rong. Chinese J. Anal. Chem.，? 2019，? 47（2）： 297-305

    李晓丹， 汪建妹， 王向军， 杨 华， 吉小凤， 徐 杰， 钱鸣蓉. 分析化学， 2019，? 47（2）： 297-305

    3 YQ 50-2014， Maximum Residue Limits for Pesticides in Tabacco. Enterprise Standard of China National Tobacco Corporation

    烟叶农药最大残留限量.? 中国烟草总公司企业标准. YQ 50-2014

    4 HU Yan-Yun， XU Hui-Qun， YAO Jian， LV Ya-Ning， SONG Wei， LI Wen-Jing， HAN Fang， ZHENG Ping. Chinese J. Anal. Chem.，? 2014，? 42（2）： 227-232

    胡艳云， 徐慧群， 姚 剑， 吕亚宁， 宋 伟， 李文静， 韩 芳， 郑 平.? 分析化学，? 2014，? 42（2）： 227-232

    5 ZHANG Wei-Guo， GAO Jin-Shan， CHEN Shan-Shan， LI Chong-Jiu. Chinese J. Anal. Chem.，? 2005，? 33（10）： 1442-1444

    张伟国， 高金山， 陈姗姗， 李重九.? 分析化学，? 2005，? 33（10）： 1442-1444

    6 SHEN Wei-Jian， MAO Ying-Min， WU Bin， SHEN Chong-Yu， JIANG Yuan， ZHAO Zeng-Yun， LIU Han， GONG Yu-Xia， LIAN Hong-Zhen.? Chinese J. Anal. Chem.，? 2010，? 38（7）：? 941-947

    沈伟健， 毛应民， 吴 斌， 沈崇钰， 蒋 原， 赵增运， 柳 菡， 龚玉霞， 练鸿振.?? 分析化学，? 2010，? 38（7）：? 941-947

    7 LOU Xiao-Hua， GAO Chuan-Chuan， ZHU Wen-Jing， BA Jin-Sha， FU Sheng， YANG Mei， YI Zhong-Ren. Acta Tabacaria Sinica，? 2017，? 23（1）：? 8-14

    楼小华， 高川川， 朱文静， 巴金莎， 扶 胜， 杨 梅， 易重任.? 中国烟草学报，? 2017，? 23（1）：? 8-14

    8 Simoncelli S， Roller E M， Urban P， Schreiber R， Turberfield A J， Liedl T， Lohmüller T. ACS Nano，? 2016，? 10（11）：? 9809-9815

    9 Craig A P， Franca A S， Irudayaraj J. Annu. Rev. Food Sci. Technol.，? 2013，? 4（1）：? 369-380

    10 Wei L， Liu C， Chen B， Zhou P， Li H C， Xiao L H， Yeung E S. Anal. Chem.，? 2013，? 85（7）：? 3789-3793

    11 Shende C， Inscore F， Sengupta A， Stuart J， Farquharson S. Sens. Instrum. Food Quality Safety，? 2010，? 4（3-4）：? 101-107

    12 HUANG Shuang-Gen， WANG Xiao， WU Yan， LIU Mu-Hua. Spectroscopy and Spectral Analysis，? 2019，? 39（1）：? 130-136

    黃双根， 王 晓， 吴 燕， 刘木华.? 光谱学与光谱分析，? 2019，? 39（1）：? 130-136

    13 Li X Z， Zhang S， Yu Z， Yang T Y. Appl. Spectrosc.，? 2014，? 68（4）：? 483-487

    14 ZHU Xiao-Yu， AI Shi-Rong， XIONG Ai-Hua， DU Juan， HUANG Jun-Shi， LIU Peng， HU Xiao， WU Rui-Mei. Spectroscopy and Spectral Analysis，? 2020，? 40（2）： 550-555

    朱晓宇， 艾施荣， 熊爱华， 杜 娟， 黄俊仕， 刘 鹏， 胡 潇， 吴瑞梅.? 光谱学与光谱分析，? 2020，? 40（2）： 550-555

    15 YANG Yong-An， ZHANG De-Qing， LI Lun， SI Min-Zhen. Acta Laser Biology Sinica，? 2019，? 28（2）： 188-192

    杨永安， 张德清， 李 伦， 司民真. 激光生物学报，? 2019，? 28（2）： 188-192

    16 Crofton K M . Toxicol. Lett.， 1996，? 84（3）： 155-159

    17 WU Lei， JIN Zhou-Yu， LI Yu-Ting， HU Wei. Heilongjiang Science and Technology Information，? 2016，? 29： 18-19

    吴 雷， 金周雨， 李雨婷， 胡 薇.? 黑龙江科技信息，? 2016，? 29： 18-19

    18 Zhang R， Yang H F， Sun Y P， Song W， Zhu X， Wang N， Wang Y， Pan Y C， Zhang Z R. J. Phys. Chem. C，? 2009，? 113（22）：? 9748-9754

    19 Chen X F， Fan W， Zhou X G， Liu S L. Chin. J. Chem. Phys.，? 2019，? 32（5）：? 553-562

    20 LI Hui-Zhi， ZHOU Chang-Li， YANG Jun. Chinese J. Anal. Chem.，? 2002，? 30（11）： 1359-1362

    李慧芝， 周长利， 杨 军.? 分析化学， 2002，? 30（11）： 1359-1362

    Simultaneous Determination of Triadimenol and Triadimefon

    in Raw Tobacco by Surface-enhanced Raman Spectroscopy

    LI Xia1， CHEN Xiao-Shui1， HUANG Yi-Wei2， YANG Jun1， WEN Bao-Ying2，

    ZHOU Guo-Jun1， LI Jian-Feng2

    1（China Tobacco Zhejiang Industrial Co. Ltd.， Hangzhou 310008， China）

    2（College of Chemistry and Chemical Engineering， Xiamen University， Xiamen 361005， China）

    Abstract Surface-enhanced Raman spectroscopy （SERS） can obtain highly sensitive structural information of substances with ultralow concentration or even at the single-molecule level. Herein， a rapid detection method for triadimenol and triadimefon in raw tobacco was established using SERS combined with portable Raman spectrometer. In this method， polyamide under acidic conditions was used as a purifying agent to remove the interference from pigments， phenols， organic acids and other impurities in tobacco. Gold-based SERS substrates were used to amplify the Raman signals through the adsorption of triadimenol and triadimefon on the surface of gold nanoparticles. It was found that the detection sensitivity of triadimenol and triadimefon residues in raw tobacco was 1 mg/kg， and the time needed was 8-12 min. This method was simple， low-cost， and accurate， thus was suitable for the rapid detection of triadimenol and triadimefon pesticide residues in tobacco.

    Keywords Surface-enhanced Raman spectroscopy; Tobacco; Pesticide residues; Triadimenol; Triadimefon; Polyamide; Rapid detection

    （Received 4 August 2020; accepted 8 September 2020）

    This work was supported by the National Natural Science Foundation of China （Nos. 21925404， 21775127） and the Project of China Tobacco Zhejiang Co. Ltd. （No. ZJZY2019C005）.

    2020-08-04收稿; 2020-09-08接受

    本文系國家自然科学基金项目（Nos. 21925404、21775127）和浙江中烟工业有限责任公司科技项目（No. ZJZY2019C005）资助

    *E-mail： zhougj@zjtobacco.com; Li@xmu.edu.cn