Label-free定量蛋白质组学揭示GATA6调控胃癌细胞对曲妥珠单抗耐药的信号通路

    刘文虎 袁江北 常晋霞

    

    

    

    摘?要?肿瘤细胞对曲妥珠单抗耐药是导致其化疗失败的主要原因。前期研究表明，在曲妥珠单抗耐药胃癌细胞 （NCI N87/R） 中，转录因子GATA6与DNA的结合活性显著增强，这与其耐药是否有关尚不清楚。本研究以NCI N87/R为研究对象，采用Crispr/Cas9技术构建GATA6敲除细胞系（NCI N87R/GATA6）。在此基础上，基于Label-free定量蛋白质组学技术并结合生物信息学分析GATA6调控曲妥珠单抗耐药的信号通路。蛋白样品经还原烷基化，FASP酶切，肽段经液相色谱分离，LC-MS/MS定量分析，通过差异倍数及t检验筛选差异表达蛋白;采用WebGestalt数据库进行基因本体分析，利用GeneAnalytics数据库进行通路富集分析。结果表明，敲除GATA6增强了曲妥珠单抗对NCI N87/R的抑制作用，降低其侵袭。采用质谱定量检测出5792种蛋白质，其中305种在NCI N87R/GATA6细胞中表达上调，182种表达下调。通路富集分析显示，线粒体转运、细胞凋亡、DNA损伤、葡萄糖代谢、丙酮酸代谢及TCA 循环、Wnt/β-catenin降解通路在NCI N87R/GATA6细胞中显著改变。蛋白免疫印迹实验（Western blot）表明，線粒体动力蛋白OPA1和DNM1L、凋亡蛋白Caspase-9、TCA 循环代谢酶SUCLG2和MDH1、糖原代谢酶PYGL在NCI N87R/GATA6中显著改变，表明GATA6敲除导致NCI N87/R细胞线粒体功能障碍、能量代谢异常，进而诱导其凋亡，提示抑制GATA6转录活性可能是逆转胃癌曲妥珠单抗耐药的有效途径。

    关键词?曲妥珠单抗; 抗药性; Label-free定量蛋白质组学; GATA结合蛋白-6; 信号通路

    1?引 言

    胃癌是消化系统常见恶性肿瘤，其发病率在所有肿瘤中位居第五，死亡率居第三[1]。化疗是当前胃癌治疗的主要手段。近年来，随着肿瘤生物学的快速发展及肿瘤分子标志物的不断发现，靶向治疗已成为胃癌治疗的有效途径。曲妥珠单抗是靶向人表皮生长因子受体-2 （Human epidermal growth factor receptor-2， HER-2）的抗体类药物，通过拮抗HER-2信号转导及抗体依赖细胞介导的细胞毒作用，发挥抗肿瘤作用，为HER-2阳性乳腺癌、胃癌及胃食管交界癌靶向治疗的经典药物[2，3]。虽然曲妥珠单抗的抗肿瘤机制明确，疗效肯定，然而肿瘤细胞对其产生抗药性已成为制约其治疗效果的棘手问题。因此，探究曲妥珠单抗耐药机制，发现耐药靶标，对提高胃癌化疗有效性及敏感性具有重要意义。

    蛋白质组学是以生命体全部蛋白质为研究对象，对蛋白质进行定性和定量分析，进而揭示蛋白质功能的学科。近年来，随着高通量、高灵敏和快速扫描质谱仪的出现，结合微量蛋白质分离技术，以质谱为检测手段的蛋白质组学技术得到了飞跃发展，并在生命科学领域得到广泛应用[4，5]。

    GATA结合蛋白6（GATA6）属于GATA家族成员，包含2个锌指结构，通过与靶基因序列[（A/T）GATA（A/G）]结合，参与调控细胞的增殖及分化。研究发现，GATA6异常表达与肿瘤的转移及恶性行为关系密切，且在不同肿瘤中具有组织特异性和功能多样性，如在胰腺癌、结肠癌、食管癌中具有促癌作用[6～8]，而在卵巢癌、胶质瘤中具有抑癌作用[9，10]。乳腺癌中GATA6通过上调slug的表达促进癌细胞发生上皮-间质转化[11]，而结肠癌中通过调节尿激酶纤溶酶原激活因子促进肿瘤侵袭[7]。另有研究表明，GATA6通过上调自噬促进非小细胞肺癌对埃罗替尼耐药[12]，通过抑制Wnt/β-catenin信号降低西妥昔单抗对结直肠癌耐药[13]，提示GATA6异常表达与肿瘤耐药有关，但GATA6是否调控胃癌细胞对曲妥珠单抗耐药，尚不明确。

    本研究组前期研究表明[14]，在曲妥珠单抗耐药的NCI N87/R细胞中，GATA6与DNA的结合活性显著增强，提示GATA6作为癌基因在曲妥珠单抗耐药中具有重要作用。本研究以NCI N87/R细胞为研究对象，采用Crispr/Cas9构建GATA6敲除细胞（NCI N87R/GATA6），探究GATA6敲除对NCI N87/R细胞曲妥珠单抗耐药的影响，在此基础上，基于Label-free定量蛋白质组学技术并结合生物信息学技术分析了GATA6调控胃癌细胞对曲妥珠单抗耐药的信号通路及可能机制。

    2?实验部分

    2.1?仪器与试剂

    LTQ-Orbitrap Velos Pro质谱仪、Easy-nLC 2000 nano高效液相色谱仪（美国Thermo Fisher公司）; SONICS多功能超声仪（美国Sonics公司）; GL-802B型真空泵（海门其林贝尔仪器公司）; 5810R真空浓缩仪（德国Eppendorf公司）; CKX31型光学显微镜（日本Olympus公司）; LRH-70生化培养箱（上海一恒科学仪器公司）; 小型Trans-Blot电泳转印槽（美国伯乐生物公司）。

    NCI N87和NCI N87/R细胞由军事医学科学院施明教授惠赠，NCI N87R/GATA6细胞由实验室构建。注射用曲妥珠单抗（440 mg， S20060026， 罗氏制药公司）; 胎牛血清（Fetal bovine serum， FBS，美国Gibco公司）; DMEM培养基、胰酶（美国Mediatech公司）; 双抗（北京钮英泰克生物有限公司）; 二硫苏糖醇（Dithiothreitol， DTT）、吲哚-3-乙酸（Indole-3-acetic acid， IAA）、尿素、NaHCO3（美国Sigma公司）; 甲醇、乙醇、乙腈、甲酸、蛋白酶抑制剂（美国Thermo Fisher公司）; Bradford蛋白浓度试剂盒（北京康为生物有限公司），一抗OPA1（67589）、DNM1L （5391）、Caspase-9（7237）和GAPDH（5174） （美国CST公司）; SUCLG2（ab96172）、MDH1（ab180152）和PYGL（ab198268） （英国Abcam公司）; 羊抗兔（或鼠）IgG二抗（碧云天生物技术公司）; Lipofectamine 2000 （美国Invitrogen公司）; BsmBI （美国NEB公司）; T4连接酶（日本TAKARA公司）; CCK-8 kit（日本同仁化学研究所）。

    2.2?实验方法

    2.2.1?细胞培养?细胞于DMEM培养液（10% FBS和1%双抗） 中，在5% CO2、37℃条件下培养，细胞2次传代后用于实验。为保持细胞的耐药性，NCI N87/R和NCI N87R/GATA6细胞培养液中加入终浓度为80 μg/mL的曲妥珠单抗[13]。

    2.2.2?gRNA及寡核苷酸链合成?依据网站http：//crispr.mit.edu设计GATA6的gRNA，在线选取得分最高的前两个核苷酸序列，分别为： ①正向5'-CACCGGAGGCGGCGGCCGGACCCC-3'，反向3'-AAACGGGGTCCGGCCGCCGCCTCC-5'; ②正向5'-CACCGGCGGAGAGCGGGGCCCCGG-3'， 反向3'-AAACCCGGGGCCCCGCTCTCCGCC-5'。

    2.2.3?Cas9-GATA6 gRNA载体构建?使用BbsI酶切Cas9质粒，gRNA靶序列与Cas9质粒经T4连接酶连接后转化到大肠杆菌BH5α感受态细胞中，涂布于LB-Amp平板上，取单克隆分析测序，确定gRNA载体构建成功（Cas9-GATA6 gRNA）。

    2.2.4?細胞转染及筛选

    将2 μg Cas9-GATA6、6 μg gRNA、1 μg pMD 2.G和1.5 μg psPAX2混合质粒及15 μL Lipofectamine 2000转染试剂分别加入100 μL无血清无抗性培养基，室温孵育10 min，共转染至293T细胞包装慢病毒，并用特异靶向敲除绿色荧光蛋白的gRNA与pMD2.G、psPAX2共转染作为对照，培养72 h后收集上清液，慢病毒液经0.45 μm滤膜过滤，

    80℃保存备用。将NCI N87/R细胞按每孔105 Cell/mL接种于六孔板，培养至70%更换无血清培养液，慢病毒感染细胞，48 h后加入0.5 μg/mL嘌呤霉素处理细胞72 h，流式分选单细胞于96孔板中，扩大培养，PCR初选（引物序列正向： 5'-TCCAGCGCGGGAGCCCT-3'， 反向： 5'-GCGCCGAAGGTCCGTGG-3'）， 蛋白免疫印迹实验 （Western blot） 验证。

    2.2.5?CCK-8检测细胞增殖?对数期NCI N87、NCI N87/R和NCI N87R/GATA6细胞分别接种于96孔板中，每孔含细胞数约5000个，按文献[15]的方法检测细胞增殖能力。

    2.2.6?Transwell检测细胞侵袭?于Transwell小室的上室中加入200 μL不含血清的DMEM培养基，将对数期NCI N87、NCI N87/R和NCI N87R/GATA6细胞分别重悬，按文献[16]的方法进行Transwell实验，每个样本随机选取6个视野拍照，记录穿膜细胞数，统计分析。

    2.2.7?Western blot检测蛋白质表达?提取NCI N87/R 和NCI N87R/GATA6细胞全蛋白质，按文献[15]的方法进行蛋白质变性、聚丙烯酰胺凝胶电泳、湿法转膜、封闭、孵育抗体及显影。抗体OPA1、DNM1L、Caspase-9、SUCLG2、MDH1、PYGL和GAPDH按1∶1000稀释，二抗按1∶5000稀释。采用 Image J 进行灰度值分析，GraphPad Prism 7.04进行定量分析。

    2.3?色谱及质谱条件

    2.3.1?色谱条件?Easy nLC 2000 nano高效液相色谱仪，使用反相C18分离柱（2 cm×100 μm×3 μm）和C18分析柱（15 cm×75 μm×3 μm， 美国Thermo Fisher公司）。液相色谱分离条件：流动相A为水（0.1%（V/V）甲酸），流动相B为乙腈（0.1%甲酸），梯度洗脱： 0～5 min，0～5% B; 6～90 min，6%～35% B; 91～110 min，36%～98% B; 111～120 min，2% B; 流速200 nL/min。

    2.3.2?质谱及其检测参数?LTQ-Orbitrap Velos Pro型质谱仪，电喷雾（Electrospray ionization， ESI）离子源，电压为3.8 kV，毛细管温度350℃，源加热温度300℃，鞘气流速40 arbitrary units，辅助气10 arbitrary unit; Orbitrap一级扫描质荷比（m/z） 200～2000，分辨率30000，数据格式Profile，多级质谱扫描分辨率7500，数据格式Centroid，多级碎裂模式为碰撞诱导解离，归一化裂解能量为35%。离子扫描电荷数范围+2～+6，排除同位素干扰峰，动态排除重复时间为10 s，重复次数为5，排除列表大小为50，排除时间为20 s，高、低排除质量宽度为3.0 Da。

    2.4?细胞全蛋白提取

    收集细胞沉淀，使用预冷磷酸盐缓冲液（Phosphate buffer solution， PBS）洗涤2次，加入8 mol/L尿素（含1%蛋白酶抑制剂），涡旋30 s，冰上裂解10 min，超声2 min，12000 r/min离心15 min （4℃），取上清液， 用Bradford法测定蛋白浓度。

    2.5?还原烷基化及FASP酶切[17]

    用50 mmol/L NH4HCO3分别配制0.5 mol/L的DTT和IAA。取蛋白样品100 μg，加入DTT（终浓度为20 mmol/L），混匀，56℃反应30 min，冷却后加入IAA（终浓度为50 mmol/L），混匀，室温避光30 min，加入20 mmol/L DTT，室温避光15 min，12000 r/min离心5 min，上清液转入超滤管（MWCO 10 kD），12000 r/min 离心40 min，加入300 μL 50 mmol/L NH4HCO3，12000 r/min离心3次，每次40 min。加入50 μL 50 mmol/L NH4HCO3和5 μg 胰蛋白酶混合液，37℃孵育4 h，补加150 μL 50 mmol/L NH4HCO3和 5 μg胰蛋白酶，37℃酶切过夜，12000 r/min离心40 min，以300 μL水清洗1次，合并两次洗脱液，减压得肽段样品。

    2.6?肽段分离

    肽段经Waters 2695 HPLC分离，流动相A为水，流动相B为乙腈。洗脱梯度：0～34 min，0～98% B; 35 ～40 min，98% B。流速0.5 mL/min，按1 min/管收集肽段洗脱液，合并（方法为：① 1、6、11、16、21; ② 2、7、12、17、22; ③ 3、8、13、18、23; ④ 4、9、14、19、24; ⑤ 5、10、15、20、25; ⑥ 26～30; ⑦31～35; ⑧ 36～40），得到8个混合肽段组分，60℃减压干燥，采用质谱检测。

    2.7?肽段检测、定量及差异表达蛋白质的筛选

    肽段样品经0.1%甲酸复溶，12000 r/min离心10 min，取上清液，经高效液相色谱分离后进入质谱仪在线检测，搭载Mascot 2.3 搜索引擎的Proteome Discover 1.4搜库，数据库为美国国家生物信息技术中心人源Refseq蛋白质序列库。检索参数：母离子质量公差为20 ppm，子离子为0.5 Da。蛋白质修饰：半胱氨酸脲甲基化（Carbamidomethylation）为固定修饰，蛋氨酸N-乙酰化及氧化（N-term acetylation， oxidation）為动态修饰，采用Percolator正/反库匹配搜索，肽段水平错误发现率（False discovery rate， FDR）设定小于1%。

    使用数据依赖分析（Data dependence analysis， DDA）采集数据，基于强度定量法（Intensity based absolute quantification， iBAQ）进行蛋白质定量[18]，采用FOT（Fraction of total）表示蛋白质标准化后的峰值，含义为每个蛋白质的iBAQ除以样本中全部蛋白的iBAQ （即FOT = iBAQ/∑iBAQ）[19]。为方便计算，FOT×105= iFOT。肽段筛选标准为：每个蛋白质被检测到的特异性肽段数≥1，Mascot≥20。采用差异倍数及双样本等方差假设t检验进行差异蛋白质筛选，规定若某蛋白的定量值在两组样本中的均值之比≥2或≤0.5，且满足p<0.05，则此蛋白质在两组样本中的表达具有差异。

    3?结果与讨论

    3.1?NCI N87R/GATA6细胞构建及评价

    基于Crispr/Cas9构建NCI N87R/GATA6细胞，Western blot及质谱定量分析结果证实，GATA6在NCI N87/R细胞中被完全敲除，表明NCI N87R/GATA6细胞构建成功（图1A和1D，本研究中使用NCI N87R/GATA6 gRNA1细胞系进行实验）。Transwell实验结果表明，NCI N87/R细胞的侵袭能力较NCI N87显著增加（p=0.01），而敲除GATA6使NCI N87/R的侵袭潜能降低（p=0.04） （图1B）; 进一步采用CCK-8试剂盒检测了曲妥珠单抗对NCI N87、NCI N87/R和NCI N87R/GATA6细胞的抑制作用，显示曲妥珠单抗对NCI N87细胞抑制最强，NCI N87R/GATA6次之，而NCI N87/R最不敏感（图1C），提示敲除GATA6增强了曲妥珠单抗对NCI N87/R细胞的抑制作用。

    3.2?细胞全蛋白检测及定量分析

    为明确GATA6敲除对NCI N87/R细胞曲妥珠单抗耐药的影响，采用Crispr/Cas9构建NCI N87R/GATA6细胞，基于Label-free定量蛋白质组学技术对两组细胞的全蛋白定量分析，考察GATA6敲除对NCI N87/R细胞表达谱的影响，并采用生物信息学筛选差异表达蛋白质，探究GATA6调控曲妥珠单抗耐药的信号通路及可能机制，实验流程如图2所示。

    3.3?数据质控分析

    对NCI N87/R和NCI N87R/GATA6细胞样本分别进行3次生物学重复，基于Spearman 方法进行相关性分析。结果显示，组内各样本的相关系数均大于0.90 （电子版文后支持信息图S1），表明实验重复性和稳定性良好。

    3.4?蛋白表达谱轮廓分析

    先分析了两组样本蛋白质表达谱的整体变化，并采用主成分分析法（Principal compnent analysis， PCA）进行轮廓辨析，得到样品组内、组间得分图。

    由图3可知，NCI N87R和NCI N87R/GATA6对应的样本分别沿主成分1和主成分2 （Principal component， PC1和PC2）分开，且承载样本信息的圈在组内聚集良好， 而组间明显偏离（图3A）。从热图（图3B）得知，组内蛋白质表达水平相似，而组间差异较大，表明GATA6敲除对NCI N87R细胞蛋白质表达谱产生了明显影响。

    3.5?蛋白质鉴定及差异蛋白质的筛选

    为保证肽段定量的准确性及鉴定蛋白的可靠性，将肽段水平的卡值设置为“Strict”，并在蛋白水平设置≤1% 的FDR，共鉴定到5792种蛋白质，其中3792种蛋白在每组细胞的2个以上样本中被定量测定，将这3792种蛋白质用于生物信息学分析。为明确数据分布，对NCI N87/R和NCI N87 R/GATA6样本中蛋白质的变化倍数（Fold change，FC）分析，即将NCI N87/R和NCI N87R/GATA6样本3次重复实验中的蛋白质峰面积均值之比作为变化倍数，再进行对数转化，发现95%以上的蛋白质在两组样本中的FC值（NCI N87/R/NCI N87R/GATA6）在2倍范围内，数据呈正态分布（电子版文后支持信息图S2A）。 因此，数据分析适合独立样本t检验。进一步根据显著性水平及均值的变化倍数绘制了火山图（电子版文后支持信息图S2B）。规定若某蛋白质在3次独立实验中的均值在两组样本中的比值≥2或≤0.5，且p<0.05，则此蛋白质在两组样本中的表达具有差异，上调蛋白在火山图中对应的点被标注为红色，下调蛋白对应的点被标注为蓝色，除此以外的蛋白认为在两组样本中的表达未发生显著变化，被标注为灰色。结果表明，487种蛋白在NCI N87R/GATA6中的表达发生了变化（p0.05）。

    3.6?差异表达蛋白质基因本体分析

    通过WebGestalt （http：//bioinfo.vanderbilt.edu/webgestalt/option.php）数据库对差异表达蛋白质从生物学过程（Biological process，BP）、细胞成分（Cellular component，CC） 和分子功能（Molecular function，MF）方面进行基因本体分析（电子版文后支持信息图S3）。细胞成分中，表达上调的蛋白主要定位于线粒体基质、线粒体内膜及线粒体复合物，下调的蛋白主要定位在线粒体基质、线粒体外膜及局部黏附; 分子功能方面，表达上调的蛋白质表现为调节核苷及GTP连接，下调的蛋白主要参与调控激酶活性; 生物学过程方面，表达上调的蛋白主要参与调控中性粒细胞在免疫中的调节及代谢作用，而下调的蛋白在物质转运、信号通路、细胞分化等方面具有重要作用。

    3.7?通路富集分析

    利用GeneAnalytics数据库（https：//ga.genecards.org/）对差异表达蛋白质进行通路分析，并用气泡图对前20个通路（p<1×10

    3）可視化展示（图4）。结果表明，丙酮酸代谢和TCA 循环（p=5.33×10

    5）、细胞凋亡（p=4.19×10

    5）、DNA损伤（p=2.42×10

    5）、线粒体转运（p=3.56×10

    5）、葡萄糖代谢（p=3.04×10

    5）、 Wnt/β-catenin降解（p=6.18×10

    5）通路显示较小p值（相关蛋白定量见图4B），提示GATA6敲除导致NCI N87/R细胞的多条通路发生改变。

    采用Western blot检测了OPA1、DNM1L、Cleaved caspase-9、SUCLG2、MDH1及PYGL的表达，以进一步评价质谱定量分析的结果。结果表明，上述蛋白在NCI N87/R和NCI N87R/GATA6细胞中的变化趋势与质谱定量分析结果一致（图5）。

    众所周知，线粒体不仅对维持细胞稳态至关重要，而且在调控细胞能量代谢、诱导内源性凋亡过程中必不可少。线粒体诱导的细胞凋亡与其内外膜的融合及分裂过程密切相关[20，21]。生理情况下，线粒体膜融合与分裂之间存在动态平衡，但在DNA损伤、外界刺激或基因缺失时，上述平衡被打破，导致线粒体物质转运异常[22]。作为线粒体内膜融合调控基因，OPA1缺失或表达下调可引起线粒体融合能力降低，结构呈片段化，也可以引起线粒体内膜结构嵴改变，而结构嵴改变与线粒体诱导的凋亡直接相关[22，23]。另一方面，作为线粒体重要分裂调控基因，DNM1L对维持线粒体形态及功能至关重要，在凋亡早期，DNM1L从细胞质募集到线粒体外膜，启动线粒体分裂机制，当DNM1L缺失或下调时，不仅线粒体分裂能力下降，而且其能量代谢异常，细胞凋亡启动，且DNM1L的突变引起线粒体外膜延伸，形态改变[24]。结果显示，NCI N87R/GATA6细胞中DNM1L表达上调，OPA1表达下调，且调控线粒体膜延伸相关蛋白（MRPS35、MRPL42、MRPL38、MPRL37、MRPL49、MRPL4、MRPS23、MRPS15、MRPL28和MRPL44）的表达发生变化，表明线粒体结构及功能发生异常。此外，NCI N87R/GATA6细胞中凋亡相关蛋白（Caspase-4、Caspase-9）表达上调，而细胞周期蛋白（CDK4、CDK6、CDK16、CDK5、CDK2和CDK9）表达均下调。据此推断，GATA6敲除导致NCI N87/R细胞线粒体功能障碍，能量代谢异常，DNA损伤，细胞周期阻滞，经线粒体途径诱导NCI N87R/GATA6凋亡，这可能是GATA6敲除导致NCI N87/R细胞对曲妥珠单抗增敏的重要原因。

    葡萄糖经糖代谢途径转化为丙酮酸，后者经三羧酸循环（TCA cycle）产生ATP，因此，葡萄糖是肿瘤细胞获取能量的直接来源。琥珀酰辅酶A连接酶2（SUCLG2）是催化琥珀酸合成琥珀酰辅酶A （Succinyl-CoA）的关键酶，后者经琥珀酰辅酶A转移酶（SCOT）催化，将辅酶A转移至乙酰乙酸，催化合成乙酰乙酰辅酶A （Acetoacetyl-CoA），而Acetoacetyl-CoA断裂生成乙酰辅酶A （Acetyl-CoA）进入TCA循环[25]。结果表明，GATA6敲除导致NCI N87R/GATA6细胞中SUCLG2表达下调，而低水平的SUCLG2使肿瘤细胞代谢受阻，ATP生成减少，导致肿瘤细胞增殖、侵袭及转移能力降低。另一方面，作为糖代谢的关键酶，苹果酸脱氢酶（MDH1）能够催化苹果酸转化为草酰乙酸，后者经氧化转变为ATP。结果显示，GATA6敲除导致NCI N87R/GATA6细胞MDH1低表达，提示GATA6直接或间接影响了NCI N87R/GATA6细胞TCA循环，进而导致能量供应失衡，细胞增殖受限。

    糖原代谢是肿瘤细胞能量代谢的重要组成部分，需要多种酶的催化才能完成，其中肝型糖原磷酸化酶（PYGL）是催化糖原磷酸化生成1-磷酸葡萄糖（1-P-G）的限速酶，而1-P-G在磷酸葡萄糖变位酶（PGM-1）作用下转变成葡萄糖-6-磷酸（G-6-P），后者既可以通过糖酵解途径产生ATP，也可以进入磷酸戊糖途径产生NADPH及5-磷酸核糖，而且PYGL通过动员肿瘤细胞的糖原分解，引起肿瘤细胞的代谢内环境改变，减少肿瘤细胞活性氧（Reactive oxygen species， ROS）聚集，抑制由ROS/p53/p21通路激活引起的衰老，促进肿瘤细胞增殖[26]。PYGL异常表达与肿瘤耐药有关，抑制PYGL的活性，能够促进贝伐珠单抗的抗肿瘤效果[26]，且在胃癌多药耐药细胞珠EPG85257RDB中，PYGL表达上调，提示PYGL催化糖原分解与肿瘤耐药有关[27]。本实验结果表明，敲除GATA6能够降低NCI N87R/GATA6细胞PYGL的表达，推测GATA6可能通过调控PYGL降低NCI N87R/GATA6细胞的糖原代谢能力，进而造成糖利用减少，能量供应不足。综上所述，GATA6在胃癌曲妥珠单抗耐药中具有重要作用，其机制可能与线粒体功能异常，肿瘤细胞供能不足或代谢异常，进而通过线粒体途径诱导细胞凋亡有关。

    此外，本研究组前期研究表明[15]，Wnt/β-catenin信号通路激活对胃癌曲妥珠单抗耐药具有重要贡献。本研究表明，GATA6敲除导致Wnt/β-catenin信號通路降解蛋白表达上调（PSMB4、PSMA5、PSMA6、PSMB5、PSMD6和PSMB7），表明GATA6对Wnt/β-catenin通路具有抑制作用，提示GATA6是Wnt/β-catenin的转录抑制因子，这与文献[13]报道一致。另外，CDK5、SMAD、NF-κB及NOTCH4通路在NCI N87R/GATA6细胞中显著变化，提示GATA6还可能通过其它途径参与调控NCI N87/R细胞对曲妥珠单抗耐药，其机制有待后续探究。

    4?结 论

    采用Crispr/Cas9技术构建了GATA6敲除胃癌细胞株NCI N87R/GATA6，探究了GATA6敲除对曲妥珠单抗耐药的影响。基于Label free定量蛋白质组学技术并结合生物信息学分析了GATA6参与调控NCI N87/R细胞的信号通路，结果显示，敲除GATA6对耐药细胞线粒体功能、凋亡、葡萄糖代谢、丙酮酸代谢和TCA 循环及Wnt/β-catenin通路产生影响。本研究为逆转胃癌曲妥珠单抗耐药治疗提供了参考。

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    Label-free Quantitative Proteomics for Investigation of Signaling

    Pathways of GATA6 Regulating Trastuzumab

    Resistance in Gastric Cancer Cells

    LIU Wen-Hu1，2， YUAN Jiang-Bei4， CHANG Jin-Xia*3

    1（Research Center of Molecular Metabolomics， Xiangya Hospital Central South University， Changsha 410008， China）

    2（Department of Pharmacy， North Sichuan Medical College， Nanchong 637100， China）

    3（School of Basic Medical Sciences， North Sichuan Medical College， Nanchong 637100， China）

    4（School of Pharmaceutical Sciences and Innovative Drug Research Center， Chongqing University， Chongqing 401331， China）

    Abstract?Trastuzumab resistance is one of the principal causes of failure in tumor chemotherapy. Previous studies show that the DNA-binding activity of GATA6， a transcription factor， has a remarkable enhancement in trastuzumab resistant gastric cancer cells （NCI N87/R）， while its correlation to resistance remains unclear. In this study， Crispr/Cas9 was employed to establish a GATA6 knock-out cell line （NCI N87R/GATA6）. The signaling pathways regulated by GATA6 and related to trastuzumab resistance were investigated based on label-free quantitative proteomics combined with bioinformatics. The extracted proteins were alkylated， and digested using filter aided sample preparation （FASP）， and the peptides were separated via high performance liquid chromatography and thereafter quantified by LC-MS/MS. Differentially expressed proteins were screened by fold change and student's t-test between NCI N87/R and NCI N87R/GATA6 cells. WebGestalt website was adopted for Gene ontology analysis， and GeneAnalytics was utilized for pathway enrichment analysis. The results demonstrated that GATA6 knock-out enhanced the antiproliferative effect of trastuzumab on NCI N87/R cells and suppressed their invasion ability. A total of 5792 proteins were quantified by LC-MS/MS， among which 305 proteins were up-regulated in NCI N87R/GATA6 cells while 182 ones down-regulated. Pathway enrichment analysis revealed that mitochondrial transport， apoptosis， DNA damage， glucose metabolism， pyruvate metabolism and TCA cycle and Wnt/β-catenin degradation pathways exhibited significant changes. Western blot manifested that the expression of mitochondrial dyneins OPA1 and DNM1L， apoptosis protein caspase-9， TCA metabolic enzymes SUCLG2 and MDH1， and glycogen metabolic enzyme PYGL changed significantly in NCI N87R/GATA6 cells， manifesting that GATA6 knock-out gave rise to mitochondrial dysfunction and abnormal energy metabolism， and therefore inducing the apoptosis of NCI N87R/GATA6 cells. The result implicated that inhibiting the transcriptional activity of GATA6 could be an effective strategy to reverse trastuzumab resistance in gastric cancer.

    Keywords?Trastuzumab; Resistance; Label-free quantitative proteomics; Transcription factor GATA-6; Signaling pathway

    （Received 17 October 2019; accepted 7 November 2019）

    This work was supported by the Applied Basic Research Program of Science and Technology of Sichuan Province， China （No. 2019YJ0378）， the Project of Sichuan Province Education Department （No. 17ZB0170）， the Doctoral Program of North Sichuan Medical College （No. CBY17-QD05）， and the Program of Science and Technology of Nanchong， China （No. 18SXHZ0402）.