外泌体蛋白质组学分析在肾脏疾病诊断中的研究进展

    卢俊玲　尤燕舞

    

    [专家介绍]尤燕舞，教授，主任医师，医学博士，博士生导师，学术带头人。曾在美国洛杉矶Cedars Sinai医学中心担任博士后研究员。主要从事慢性肾脏疾病的基因、免疫及分子机制的研究。现任中国侨联特聘专家、广西医学会肾脏病学分会常务委员、广西医师协会肾脏内科医师分会常务委员、广西中西医结合肾脏病学会常务委员、广西医学会百色市肾脏病学分会副主任委员，百色市第四届政协委员，2012年入选“广西高校优秀人才计划”，先后获得“百色市专业技术拔尖人才”“中国侨界贡献奖”“优秀教师”“广西十佳青年医师”“十佳医德标兵”“教学名师”等荣誉称号。主持在研国家自然科学基金2项、广西自然科学基金4项、广西高校科研重点项目1項，主持完成广西高等教育教学改革研究课题1项。在国际、国内知名期刊公开发表论著80多篇。荣获广西科技进步二等奖、三等奖各1项，广西医药卫生适宜技术推广三等奖1项，百色市科技创新二等奖1项。

    【摘要】 外泌体是由B细胞、T细胞等细胞释放并存在不同体液中的外囊泡，其携带的蛋白质可以在细胞间转运，参与细胞的通信、物质转运以及生化组成，是目前精准医学的研究热点。外泌体蛋白质在多种人类疾病诊疗中占有重要地位，而肾脏疾病具有发病机制复杂、诊断难等特点，所以肾脏穿刺仍是诊断肾脏疾病的金标准，但因为属于侵入性操作故不作为诊断的首选检查，外泌体蛋白质组学分析则能精准地鉴定出多种蛋白质生物标志物，并且能较好地运用在肾脏疾病的诊疗中。该文通过不同方面讨论外泌体蛋白组学分析在肾脏疾病研究中的最新进展，有望为肾脏疾病的诊疗提供新思路。

    【关键词】 外泌体;蛋白质组学;肾脏疾病

    中图分类号：R692? 文献标志码：A

    DOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2021.02.001

    【Abstract】 ? Exosomes are vesicles released by B cells， T cells and other cells and exist in different body fluids. Proteins carried by exosomes can be transported between cells， participate in cell communication， material transport and biochemical composition. This has become a research hotspot of precision medicine. Exosomes play an important role in the diagnosis and treatment of various human diseases， while kidney diseases， because of their complicated pathogenesis and difficult diagnosis， renal puncture is still the gold standard for the diagnosis of them. However， because of its invasive operation， it is not the first choice for diagnosis of renal diseases. Exosomes proteomics analysis can accurately identify a variety of protein biomarkers， and it can be better used in the diagnosis and treatment of renal diseases. Therefore， this review discusses the latest progress of exosomes proteomic analysis in kidney disease research from different aspects， which is expected to provide new ideas for the diagnosis and treatment of kidney disease.

    【Key words】?exosomes; proteomics; kidney diseases

    随着人们物质生活水平的提高，肾脏疾病的高发病率及死亡率已成为目前重大公共卫生问题之一[1]，对肾脏疾病进行早期诊断及早期治疗尤为重要。血液和尿液检查仍是临床诊断肾脏疾病的首选，根据当前肾脏疾病改善全球预后KDIGO指南，诊断和风险分层主要是功能性标志物：肌酐和胱抑素C，肾小球滤过率（estimated glomerular filtration rate，eGFR）和分析尿白蛋白排泄作为肾脏损害的主要标志物[2]，但是这些体液检验通常因不够灵敏或特异性不足，难以作出明确的诊断。目前影像学检查在肾脏疾病的诊断中仅发挥有限的作用，主要用于诊断肾结石或大体解剖缺陷，如囊性疾病、恶性肿瘤和阻塞性肾病。重要的是，影像检查使用的造影剂拓宽了肾脏成像诊断的范围，同时也增加了肾毒性的可能。因此，肾脏穿刺仍是诊断肾脏疾病的金标准，但这种诊断操作具有侵入性，并伴有各种并发症，出血是其最大危害[3]，因此不适合在肾脏疾病诊断及监测预后中多次使用，故肾脏疾病的诊断及预后监测迫切需要新的生物标志物来敏感、特异地检测肾脏损伤并实现靶向治疗。外泌体蛋白质组学分析能精准地鉴定出多种疾病的蛋白质生物标志物，如癌症[4～5]、自身免疫性疾病[6]等，近年来，不少研究发现外泌体蛋白能较好地运用于肾脏疾病的诊疗中，因此，从不同方面讨论外泌体蛋白组学分析在肾脏疾病研究中的最新进展，有望为肾脏疾病的诊疗提供新思路。

    1?外泌体蛋白作为生物标志物载体的优势

    外泌体由B细胞、T细胞、肿瘤细胞等细胞释放并存在于血液[7]、尿液[8]、脑脊液[9]、羊水[10]等不同体液中纳米大小（30～150纳米）的外囊泡（External vesicle，EV）。在保持转移物质的生物活性的前提下，外泌体携带稳定的组织特异性蛋白质等物质转移至特定的靶细胞，改变靶细胞的生化组成以及信号通路[11～13]，同时以细胞间通信的一种新形式，以及运载工具，重新编程靶细胞来调节其生理及病理过程[14]，因此外泌体可以代表靶细胞的现阶段的状态。

    外泌体蛋白比传统的血清学标志物具有独特的功能，首先，与直接在血液中检测到的蛋白质相比，外泌体蛋白质具有更高的敏感性，致死性全身照射小鼠的尿总蛋白质组学与尿外泌体蛋白质组学之间的比较，在尿外泌体鉴定出23种差异蛋白质[15]。第二，外泌体蛋白高度稳定，脂质双层可保护外泌体蛋白免受外部蛋白酶和其他酶的侵害，磷酸化蛋白可与冷冻5年的外泌体样品分离[16]。第三，蛋白质翻译后修饰（PTM）是一种分解生命活动的重要翻译后修饰，替代生物的生长发育，信号转导，以及疾病的发生发展，可以改变蛋白质结构和活性，介导细胞信号转导，对外部环境刺激的响应往往通过PTM实现。PTM有许多形式，而磷酸化是最受瞩目的[17]。所以，使用外泌体蛋白质作为生物标志物及治疗的载体是理想的，这允许最低限度地采用非侵入性“液体活检”的方法来诊断甚至监测疾病发展。

    2?外泌体蛋白的质谱分析技术

    在1994年第一届国际双向电泳大会上，澳大利亚Macquarie大学的Wilkins首次提出蛋白质组这个概念。目前， 基于液相色谱串联质谱技术（liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry LC-MS /MS）的定量蛋白质组学技术飞速发展，已经成为蛋白质组学研究的主要分析手段。定量分析可以是绝对的也可以是相对的，实际上，MS的许多生化应用都依赖于相对定量，而相对定量则分为非标记定量技术及稳定同位素标记定量技术。2.1?非标记定量技术?非标记定量技术主要的方法如下：一种是基于质谱峰的峰面积或峰强度来进行定量[18]，另外一种是基于蛋白的肽段鉴定数来进行定量[19]。近年来，基于质谱的非标记定量技术随着其数据处理软件和程序的不断开发，该技术得到了较广泛的应用，如SAINT-MS1[20]、RIPPER[21]。非标记定量技术少了标记步骤，减少了标记时导致的误差，而且因为每个样品是分开进行分析的，所以解决了分析样品数量的烦恼，甚至可以实现同时多组生物样品的高通量定量分析。

    2.2?稳定同位素标记定量技术?蛋白质组学相对定量的经典方法——稳定的同位素标记技术，是向样品中引入稳定同位素标记，通过比较不同同位素标记物的质谱信号强度实现不同样品中蛋白质的相对定量分析。样本在质谱分析前、稳定同位素标记后混合，一次性实现差异蛋白质定量，有效消除了非标记定量分析过程中的不稳定性，最大程度减小了定量误差，主要技术包括通过细胞培养中的氨基酸对同位素进行稳定同位素标记（SILAC）、酶促标记法以及化学标记法，化学标记法是蛋白质组学研究中最常用的方法之一，因为它提供了将同位素标记选择性地引入肽或蛋白质所需位置的灵活性。它有一个类似于代谢标记的原理，化学反应是用来将这些标记合并到它们想要的位置[22]。一般的外泌体蛋白质质谱分析流程如图1。

    3?外泌体蛋白质组学在肾脏疾病诊疗中的应用

    肾脏是一个复杂的器官，对体内体液平衡起着至关重要的作用，其损伤以及改变对个人的健康产生巨大影响。肾脏的功能单位，即肾单位，在不同的结构（肾小球、小管等）和高度分化的极化上皮细胞方面显示出精细的组织结构，所有这些细胞都具有特定的转运特性。因此，编码不同蛋白质的基因突变，如受体、通道和转运蛋白、酶、转录因子和结构成分，不仅影响肾功能，而且影响肾外器官。因此，外泌体蛋白质组学在肾脏的形成及相关疾病的诊疗是具有一定潜力的。

    3.1?糖尿病肾病?糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）是一种进行性肾脏疾病，是糖尿病的主要并发症，也是终末期肾脏疾病最常见的病因，以肾病综合征和弥漫性肾小球硬化为特征。早期DN无明显的症状。目前，在诊断有糖尿病的基础上，微量白蛋白尿以及大量蛋白尿为评估糖尿病肾病风险的最佳无创性指标，但仍有其局限性。RAIMONDO等人[24]应用无标记LC-MS/MS方法从2型DN动物模型中分离出尿外泌体的差异蛋白质组，这些蛋白质主要是膜相关或细胞质的，参与运输、信号和细胞黏附，是外泌体蛋白的经典功能，提示外泌体蛋白质组学在DN生物标志物发现中的潜力。ZUBIRI等人[25]发现DN大鼠肾组织中的调节蛋白-30明显下调，同样的，在其尿外泌体也有相同的变化趋势，同时这些结果在人类样本的初步研究中得到了进一步证实。同样，ZUBIRI等[26]发现DN患者尿外泌体中AMBP、MLL3和VDAC1呈现显著的改变，表明外泌体蛋白质组学可以作为DN早期诊断和进展监测的新工具。

    3.2?高血压性肾病?蛋白尿是高血压患者中心血管风险和肾脏损害的指标，慢性肾素-血管紧张素系统（renin-angiotensin system，RAS）抑制可促进血压控制并防止新发性白蛋白尿的发展。然而，尽管存在慢性RAS阻滞，仍有大量患者发生蛋白尿，并且其生理病理机制尚未得到充分研究。GONZALEZ-CALERO等人[27]对目标患者进行了3年的随访，其分类为：a）持续性白蛋白尿患者;b）发生新蛋白尿的患者;c）维持蛋白尿的患者，组之间进行外泌体蛋白质组学分析，总共鉴定出487种蛋白质，其中48种蛋白质在对高血压和/或蛋白尿的反应中显示出改变的模式，通过GO富集分析发现顯著改变的蛋白质是免疫应答、补体激活、蛋白水解和代谢过程的主要参与者，主要与硫化合物、脂质和多糖的代谢有关。鉴定出的蛋白质构成药物开发的潜在靶标，并可能有助于确定治疗策略，以避开长期治疗的高血压患者的蛋白尿进展。

    3.3?肾结石?全球范围内，约80%的肾结石由草酸钙与磷酸钙混合而成[28]，SINGHTO等[29]发现与CaO一水化合物（CaOx monohydrate，COM）一起孵育的巨噬细胞外泌体中，Annexin A2 等26种蛋白质的含量发生了明显变化，经蛋白质网络分析表明，这些差异的蛋白质参与了细胞骨架和肌动蛋白的结合、钙结合、应激反应、转录调节、免疫反应以及细胞外基质的分解。经功能分析得知，经COM处理的外泌体增强了肾小管细胞的IL-8产生，激活了中性粒细胞迁移，增加了外泌体膜的脆性，与COM晶体的结合能力增强，随后增强了通过细胞外基质迁移腔室的晶体入侵。这表明巨噬细胞外泌体在对COM晶体的炎症反应中起重要作用，并且可能参与肾间质的晶体侵袭、转录调控、免疫应答和细胞外基质分解。因此，这些来自COM处理的巨噬细胞的外泌体诱导的协同反应极大可能促进肾结石的形成。但仍需进一步的研究，特别是在临床上证实此假设。

    3.4?心肾综合征?慢性心力衰竭（chronic heart failure，HF）破坏正常的肾功能，并导致进一步促进HF进展的心肾综合征。MELENOVSKY等人[30]在慢性容量超负荷的雄性大鼠体内使用主动脉-腔静脉瘘管诱发HF，发现HF肾脏相对于对照组，有67种蛋白质的表达差异约1.5倍，且差异最大的是血管紧张素转换酶，上调20倍，高级糖基化产物特异性受体、骨膜素、caveolin-1和其他与内皮功能有关的其他蛋白质（vWF、cavins1-3、T-kininogen2），促炎性ECM激活（MFAP4、collagen-VI、galectin-3、FHL-1、calponin）和参与肾小球滤过膜完整性的蛋白质（CLIC5、ZO-1），这些差异蛋白质可以与肾内肾素-血管紧张素系统激活协同作用，并且可以作为治疗心肾综合征的标志物以及治疗靶标。

    3.5?监测移植组织的免疫排斥反应?肾脏移植是終末期肾脏疾病的首选和最成功的治疗方法，但因为受体及供体免疫表型的因素，需要检测移植是否成活，肾穿则是监测的“金标准”，但反复的侵入性操作，产生较多的并发症风险和相对较高的费用。有研究证明肾移植后T细胞参与肾脏同种异体移植的急性排斥过程[31]，PARK团队[32]研发了iKEA监测平台——整合的肾脏外泌体测定法，此平台可检测T细胞淋巴细胞的尿液外泌体，并成功发现CD3是检测T细胞来源尿液外泌体的有效标记。SIGDEL等[33]从移植患者中鉴定出的349种外泌体蛋白中，功能上涉及炎症和应激反应的11种尿液外泌体蛋白在急性排斥患者的尿液样本中含量更高，其中3种是尿液外泌体所独有的。尿液外泌体特异的蛋白质改变提供了潜力，并提供了一组独特的敏感生物标志物来监测肾移植急性排斥。

    3.6?海绵状海绵肾病?海绵状海绵肾病（medullary sponge kidney，MSK）是一种罕见且被忽视的肾脏疾病，通常与肾钙化/肾结石病和肾盂前导管中的囊性异常有关，MSK的诊断准确性目前较低，因为它取决于个人经验，并且诊断需要有创放射线和/或肾毒性造影剂进行医学成像。BRUSCHI等人[34]从MSK患者的尿液中分离出外泌体并鉴定其中蛋白质含量，确定了由20种高区分蛋白组成的核心小组，最有特征的是Ficolin 1、甘露聚糖结合凝集素丝氨酸蛋白酶2（MASP2）和补体成分4-结合蛋白β（C4BPB），这些都是凝集素补体途径的主要调节成员，Ficolin 1可以与MASP2形成复合物以激活凝集素补体途径[35]，而在MSK患者中MASP2的下调伴随着C4BPB的上调，C4BPB是一种多聚体蛋白，通过阻止经典C3和C5转化酶的形成来抑制补体级联反应的激活[36]。这可能反映了肾脏减轻凝集素补体途径激活的生理尝试。这也可以解释FCN1和MASP2的反调控。但是，需要更多的研究来证实这种效果。所以，根据以上外泌体蛋白数据首次表明凝集素补体途径可能参与了与MSK相关的复杂生物机制。

    4?展望

    目前，随着疾病的多样化，传统的诊疗手段已满足不了人们对疾病诊疗的期望，应运而生的精准医学成为热门的话题，而外泌体蛋白质组学代表细胞的特定标记，能最大程度地反映细胞的状态，因此成为疾病诊疗的标志物的候选者，但由于目前外泌体的分离纯化以及蛋白质组学的分析技术尚未成熟，导致相关研究较少，所以，需要进一步深入研究外泌体蛋白质，尤其是肾脏疾病，甚至更多相关疾病的预防、诊断、治疗和预后等方面，从而在肾脏疾病的诊治上获得新的思路。

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    （收稿日期：2020-06-22?修回日期：2020-07-23）

    （編辑：梁明佩）