血管生成素-2上调增强血管瘤干细胞血管形成能力的研究

    张明亮 吴杉英 王彪 刘照亮 雷忱

    [摘要]目的：探究Ang2上调后对血管瘤干细胞（HemSCs）血管形成能力的影响，揭示Ang-Tie2体系在血管瘤血管发生发展过程中的作用。方法：通过免疫磁珠阳性分选技术分离纯化HemSCs，经体外培养扩增，通过慢病毒转染的方法获得Ang2上调稳定表达的HemSCs。通过血管形成实验检测Ang2上调的HemSCs血管形成能力的变化，通过WesternBlot检测相关细胞信号通路关键靶蛋白表达变化。结果：Ang2上调的HemSCs血管形成能力大于对照组;血管生成信号通路关键靶蛋白在HemSCs Ang2上调组中表达增强。结论：Ang2上调可以增强HemSCs的血管形成能力。

    [关键词]血管瘤;干细胞;血管生成素2;血管形成;信号通路

    [中图分类号]R732.2? ? [文献标志码]A? ? [文章编号]1008-6455（2020）09-0089-03

    Increased Expression of Angiopoietin-2 Enhanced Angiogenesis of Hemangioma Stem Cells

    ZHANG Ming-liang，WU Shan-ying，WANG Biao，LIU Zhao-liang，LEI Chen

    （Department of Plastic Surgery，the First Affiliated Hospital of Fujian Medical University，Fuzhou 350005，Fujian，China）

    Abstract： Objective? To investigate the effect of Ang2 up-regulation on the Angiogenic capacity in hemangioma stem cells （HemSCs） and to reveal the role of Ang-Tie2 system in the vasculogenesis of hemangiomas. Methods? Separation and purification of HemSCs by positive selected immunomagnetic beads sorting. After being cultured and amplified in vitro， up-regulation of Ang2 by stable lentiviral transfection HemSCs. The vasculogenesis ability of HemSCs cells up-regulated by Ang2 was observed by Angiogenesis Experiment. Detect the expression changes of key protein target in cell signaling pathway by Western Blot Protein. Results? Ang2 up-regulated HemSCs angiogenesis ability was greater than the control group. Key target proteins of angiogenesis signaling pathway was enhanced in HemSCs Ang2 up-regulated. Conclusion? Ang2 up-regulation can enhance HemSCs' angiogenesis ability.

    Key words： hemangioma; stem cells; angiopoietin 2（Ang2）; angiogenesis; signaling pathway

    婴幼儿血管瘤（Infantile hemangioma，IH）是一种常见的血管瘤，其独特的生长周期是在婴儿期6～8个月内迅速生长，形成大量血流紊乱的血管组织，其后3～7年缓慢自发消退[1]。虽然是婴幼儿最常见的良性肿瘤，但目前对婴幼儿血管瘤中导致血管异常增殖的机制知之甚少。血管系统的发育依赖于调节内皮细胞的增殖、迁移和分化，这两个过程称为血管生成和血管新生。在血管成熟的调节剂中，血管生成素具有特别重要的作用[2]。血管生成素（Ang）生长因子和内皮性的Ang/Tie受体调节人体组织中的血管和淋巴管發育、血管通透性、炎症、血管生成重塑和肿瘤血管形成[3]。

    Ang/Tie信号通路由两种酪氨酸激酶受体（Tie1，Tie2）和人体中已知的三种Tie2配体（Ang1，Ang2，Ang4）组成。Ang2结合内皮特异性Tie2并在血管生成过程中充当Ang1-Tie2信号传导的负调节因子，从而控制血管对外源细胞因子的反应性[4]。Ang2通过阻断Ang1的作用使血管不稳定并启动血管重塑。Ang2介导的血管重塑使血管对其他类型的血管生成因子敏感[5]。本研究通过慢病毒转染技术使血管瘤干细胞的Ang2表达水平上调，以探究在血管瘤异常血管形成过程中Ang2所起的作用。

    1? 材料和方法

    1.1 血管瘤干细胞的分离、培养：排除经药物或激光治疗的病例，选取笔者医院增殖期婴幼儿血管瘤手术标本1例。通过患者及其家属知情同意，且本研究已通过福建医科大学附属第一医院医学伦理委员会审核批准伦理审批文书批号：闽医大附一伦理医技审[067]号。将血管瘤组织用PBS清洗去除表面血凝块，用小剪刀剪成1mm3大小的组织块，加入0.2%胶原酶37℃水浴箱消化2h。以孔径为70μm的无菌滤膜过滤，获得单细胞悬液。每1×107个细胞加入20μl CD133免疫磁珠，充分混合后。将细胞悬液加入分选柱中，收集磁珠结合的CD133+细胞;以5×105个细胞/孔接种于500ng/ml的纤维连接蛋白包被的6孔培养板，置37℃、5%CO2培养箱内。24h后传代接种。

    1.2 慢病毒转染及细胞分组：根据细胞MOI及病毒滴度，干预组加入相应病毒量（Ang2上调），阴性对照组以相同条件加入无义慢病毒（Ang2-254），空白对照组以相同条件加入等体积PBS;转染成功后每孔加嘌呤霉素0.2mg/ml筛选稳转株，稳转株以筛选浓度的一半浓度的嘌呤霉素维持培养。

    1.3 血管形成实验：将圆形比例盖玻片置于12孔板中，将Matrigel按200μl/孔均匀包被盖玻片，置于培养箱孵育30min，待凝胶成固体。将三组血管瘤干细胞（HemSCs）分别以1×105个/孔接种，加培养基培养，每8h观察拍照，Image J软件计算不同组中分支点及毛细管长度。

    1.4 蛋白浓度测定：提取不同组细胞中的蛋白，BCA测定蛋白浓度。把蛋白样品（20μg）上样到SDS-PAGE胶加样孔内，转PVDF膜60min。2%的BSA室温下孵育2h，一抗4℃孵育过夜，室温孵育二抗2h，扫描成像，并分析条带灰度值。

    1.5 统计学分析：应用SPSS 23.0软件通过Student t检验或方差分析（ANOVA）进行数据统计分析，并进行后期Tukey检验。所有值以x?±s表示。以P<0.05为差异有统计学意义。

    2? 结果

    2.1 HemSCs原代分离培养结果：经免疫磁珠分选后，所得细胞形态均一，细胞纯度较高。接种4h后，即贴壁生长，细胞呈长梭形，见图1。

    2.2 HemSCs Ang2上调慢病毒转染结果：Ang2上调慢病毒转染：在MOI 30时细胞转染效率达90%，达最佳转染效果;Ang2上调慢病毒颗粒可稳定转染HemSCs，且传代后Ang2上调转染特性不变。转染后HemSCs细胞形态如图2所示，呈长梭形，与HemSCs相比无明显差别。

    2.3 血管生成实验结果：与血管瘤血管形成密切相关，可以反映毛细血管的官腔形成的早期过程。取不同实验组中的HemSCs进行血管形成实验，结果如图3所示，干预（HemSCs Ang2上调）组血管形成的节点数及毛细管长度均显著高于其余两组。

    2.4 Western Blot分析结果：为验证Ang2上调后HemSCs成管能力改变的可能信号通路，检测了影响血管生成的相关蛋白，结果如图4～5所示：Ang2、VEGF、ERK1在Ang2上调组中表达量均显著上調。

    3? 讨论

    大部分的婴幼儿血管瘤可自发向消退期转归，并不需要治疗，但在这个过程中约有10%～15%的患者会出现因为肿瘤的快速生长带来的并发症，如：出血、溃疡、外观损毁、充血性心力衰竭、永久性视力损害、气道梗阻等[6]，有时甚至危及生命。此时，为控制相关并发症通常需要对肿瘤生长进行干预。

    近年来，婴幼儿血管瘤的治疗发生了颠覆性地变化。传统一线药物糖皮质激素，已经迅速被口服普萘洛尔的新方法代替。相比于激素治疗，普萘洛尔具有迅速有效、耐受良好和安全性高的特点。然而普萘洛尔抗婴幼儿血管瘤的作用机制尚无定论。虽然其安全性高，但疗程较长。依据最新的推荐，口服普萘洛尔治疗婴幼儿血管瘤的持续用药时间应大于6个月。即便如此，也仍有10%～15%的复发率[7]。本研究以婴幼儿血管瘤病理过程为线索，探索潜在的治疗靶点及其理论依据。

    Ang-Tie2系统是血管生成和血管完整性的重要调节剂[8]。Tie2的激活状态是由Ang1和Ang2之间的相对平衡决定的，Ang2是体内Ang1的天然拮抗剂，但Ang2本身的确切功能尚不清楚。有学者认为高浓度的Ang2可以通过结合Ti2受体，并通过MAPK-ERK途径，在内皮细胞中发挥其抗凋亡作用[9]。本研究证实，Ang2在干预（HemSCs Ang2上调）组中表达量显著增加（见图4～5），且细胞有更强的成管能力（见图3）。

    为了验证这种成管能力的改变在HemSCs中是否通过MAPK-ERK信号通路途径，检测了HemSCs中MAPK-ERK通路关键靶蛋白ERK1。ERK1可以通过磷酸化多种酶、激酶和转录因子等下游因子，进而调节细胞的功能。这些作用可激活蛋白的翻译，增强细胞的生长。在本研究中干预（HemSCs Ang2上调）组ERK1表达量皆高于其余两组（见图5），这也就从一方面解释了HemSCs Ang2上调组中成管能力增强的现象。

    综上所述，本研究证明了Ang2上调可以通过增加VEGF、ERK1、Ang2等血管生成调控蛋白的表达从而增强HemSCs的血管生成的能力，Ang-Tie2体系在血管瘤血管形成过程中起一定作用。然而各种调控蛋白之间的相互作用以及血管瘤异常血管生成的原因还需要进一步的实验研究。

    [参考文献]

    [1]Léauté-Labrèze C，Harper JI，Hoeger PH.Infantile haemangioma[J].Lancet，2017，390（10089）：85-94.

    [2]Hossain MB，Shifat R，Li J，et al.TIE2 associates with caveolae and regulates caveolin-1 to promote their nuclear translocation[J].Mol Cell Biol，2017，37（21）：e00142-17.

    [3]Grant ZL，Coultas L.Growth factor signaling pathways in vascular development and disease[J].Growth Factors，2019，37（1-2）：53-67.

    [4]Fukuhara S，Sako K，Noda K，et al.Angiopoietin-1/Tie2 receptor signaling in vascular quiescence and angiogenesis[J].Histol. Histopathol，2010，25（3）：387-396.

    [5]Peterson TE，Kirkpatrick ND，Huang Y，et al.Dual inhibition of Ang-2 and VEGF receptors normalizes tumor vasculature and prolongs survival in glioblastoma by altering macrophages[J].Proc Natl Acad Sci U S A，2016，113（16）： 4470-4475.

    [6]Munabi NCO，England RW，Edwards AK，et al.Propranolol targets hemangioma stem cells via cAMP and mitogen-activated protein kinase regulation[J].Stem Cells Transl Med，2016，5（1）：45-55.

    [7]Mong EF，Akat KM，Canfield J，et al.Modulation of LIN28B/Let-7 signaling by propranolol contributes to infantile hemangioma involution[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol，2018，38（6）：1321-1332.

    [8]Moritz F，Schniering J，Distler JHW，et al.Tie2 as a novel key factor of microangiopathy in systemic sclerosis[J].Arthritis Res Ther，2017，19（1）：105.

    [9]Viallard C，Larrivée B.Tumor angiogenesis and vascular normalization： alternative therapeutic targets[J].Angiogenesis，2017，

    20（4）：409-426.

    [收稿日期]2019-12-25

    本文引用格式：張明亮，吴杉英，王彪，等.血管生成素-2上调增强血管瘤干细胞血管形成能力的研究[J].中国美容医学，2020，29（9）：89-91.