外泌体在皮肤衰老中的作用及转化应用进展

    戴雨薇 王培光 杨森

    [摘要]细胞外囊泡（Extracellular vesicles， EVs）是由细胞分泌的双层膜结构囊泡，外泌体是EVs的一个亚群，内含RNA、DNA及多种蛋白，近年来发现与皮肤衰老相关。干细胞外泌体能够减少皮肤细胞所受的辐射损害，维护皮肤屏障，且极有可能帮助恢复皮肤干细胞活力，而衰老细胞外泌体则损坏皮肤屏障结构，传递衰老信号诱导周围细胞衰老。目前干细胞外泌体转化应用的研究已取得了一定进展，但实际临床应用仍阻碍重重。

    [关键词]外泌体;皮肤;衰老;细胞外囊泡;干细胞

    [中图分类号]R339.38? ? [文献标志码]A? ? [文章编号]1008-6455（2021）01-0184-03

    The Role of Exosomes in Skin Aging and its Transformation Application Progress

    DAI Yu-wei，WANG Pei-guang，YANG Sen

    （Department of Dermatovenerology，the First Affiliated Hospital of Anhui Medical University， Hefei 230022，Anhui，China）

    Abstract： Extracellular vesicles （EVs） are bilayer membrane vesicles secreted by cells. Exosomes are a subgroup of EVs containing RNA， DNA and a variety of proteins. Stem cell exosomes can reduce the radiation damage to skin cells， maintain the skin barrier， and most likely help restore the vitality of skin stem cells， while senescent exosomes can damage the skin barrier structure and transmit senescence signals to induce the senescence of surrounding cells. At present， the research on the application of stem cell exosome transformation has made some progress， but the practical clinical application still faces many obstacles.

    Key words： exosomes;skin;senescence;extracellular vesicles;stem cells

    细胞外囊泡（Extracellular vesicles， EVs）是细胞分泌的双层脂质结构小泡，在各种细胞及组织之间起着物质传递、信息沟通的作用，其各亚群主要以直径大小区分。外泌体（约20～200nm）是EVs中的一个亚群，包含了蛋白质、脂质、多糖及RNA等物质：蛋白质主要包括骨架蛋白、膜相关连蛋白、四分子交联体家族的CD9、CD63，MHC类分子及热休克蛋白和脂质相关蛋白。脂质主要包括神经酰胺，胆固醇、磷脂酰丝氨酸和鞘磷脂，多糖主要是甘露糖。RNA主要包括了mRNA、miRNA和ncRNA等。不同的外泌体在成分上有细微的差别，体现了细胞对外泌体形成控制的精密[1]。外泌体可被绝大多数细胞分泌或胞吞，且存在于几乎所有体液之中，包括血液、尿液、唾液、乳汁、脑脊液、羊水、腹水、汗液以及月经血。

    目前，大家对外泌体的认识主要是干细胞来源的外泌体在对心血管、肝脏以及神经等多器官、系统的再生修复方面[2]，这显示了干细胞来源外泌体在抗衰老方面的潜力。同时，又有研究表明[3]，衰老成纤维细胞（HDFs）表达的外泌体增加了4倍，而HDFs分泌弹力蛋白、胶原蛋白等物质，在维持皮肤的弹性及水分中发挥重要作用—这提示了衰老细胞来源的外泌体在皮肤衰老过程中可能的作用。

    本文将不同来源的外泌体与皮肤衰老的关系做一综述，并将通过外泌体的转化应用研究来展望其在皮肤老化治疗中的潜力。目前，由于外泌体鉴定技术的限制以及定义直径尚未统一，部分文献仍以EVs通称，但其实验所验证的功能与其他文献中外泌体功能有重合，现综述如下。

    1? 干细胞外泌体对衰老的调节

    有研究用人类多能干细胞外泌体（IPSCS-EXO）分别来处理UVB照射后及体外传代30代以上的HDFs，结果发现IPSCS-EXO在正常条件下可以促进两种HDFs的增殖和迁移，提高两者I型胶原的表达;并显著降低后者衰老相关-半乳糖苷酶（SA-BETA-GAL）和金属蛋白酶（MMP-1/3）的表达水平，而SA-BETA-GAL的高表达一直是自然衰老的标志，MMP也是细胞衰老过程中高表达的重要酶物质。IPSCS-EXO预处理结果则是抑制UVB辐照引起的损伤和MMP-1/3过表达[4]。另一项研究与其结果相似，互相印证：人脂肪源性干细胞EVs不仅增强了UVB輻照后HDFs的迁移能力，还可显著抑制UVB照射诱导的MMP-1、MMP-2、MMP-3和MMP-9的过表达，增强Ⅰ型胶原、Ⅱ型胶原、Ⅲ型胶原和Ⅴ型胶原及弹性蛋白的表达。在其预处理的HDFs中，UVB照射后组织金属蛋白酶抑制剂（TIMP）-1和转化生长因子（TGF）-beta1的表达显著增加，而这两种物质是参与MMP抑制和细胞外基质合成的重要因子[5]。以上两项实验体现了干细胞外泌体改善光老化的积极作用。

    此外，在人类脂肪组织来源的间充质干细胞外泌体（ASC-EXOSOMES）与特应性皮炎（AD）的研究中，外泌体还被发现可以通过皮下注射的形式刺激神经酰胺的合成[6]。神经酰胺是增加皮肤角质层水合度，维持皮肤屏障、抗衰老及美白等方面的重要物质，也是如今抗衰老的热门成分。

    皮肤组织存在少量的成体干细胞—具有多向分化潜能，是维持皮肤年轻态的储备力量[7]，其衰竭是皮肤衰老的重要原因之一。有学者发现高度纯化的IPSCS-EXO用于培养活性氧（ROS）水平升高的衰老间充质干细胞（MSCs）时，MSCs的ROS水平可降低，衰老表型减轻。因此，来自人类干细胞的外泌体可以缓解干细胞在培养中的老化[8]。另一项研究也发现了胚胎干细胞EVs在体外能显著恢复衰老的MSCs活力[9]。这些实验结果可以从一定程度上预示干细胞外泌体对衰老皮肤成体干细胞的积极作用。

    2? 衰老细胞外泌体对衰老的影响

    MiR-23a-3p过表达会使HDFs透明质酸（HA）分泌减少，衰老相关标志物上调，增殖受抑[10]。国外有学者在2D细胞培养和人体皮肤等效物中，发现miR-23a-3p还可以外泌体形式从真皮衰老HDFs分泌，继而作用到表皮角质形成细胞，而后者在其不间断刺激下分化受阻[11]。角质层的分化不完全直接导致皮肤屏障的损伤，皮肤脆弱易衰老。

    另一个研究在发现衰老HDFs来源EVs对角质形成细胞分化及屏障功能维持的消极作用同时，也发现了其促炎因子IL-6水平的升高[12]。近年来，越来越多的实验证明外泌体是细胞衰老相关分泌表型 （SASP）中的一种，SASP可诱导邻近细胞中DNA损伤反应（DDR）激活和SASP的产生，从而在局部和最终在全身水平上创造炎症环境[13]。炎症环境可能会加速炎症性衰老，这是一种慢性、全身性，与年龄相关的炎症状态，并易于发展成与年龄相关的疾病（ARDs）[14]。还有研究发现了DNA受损细胞分泌的EVs会影响端粒的调节[15]，而端粒变化已被公认与细胞衰老相关。

    除此之外，衰老黑素细胞来源的外泌体也被发现参与了皮肤细胞衰老，有人发现生理剂量UVA+UVB处理过的黑素细胞在出现衰老表型后产生携带特殊miRNA的外泌体，而这些外泌体miRNA靶向的DNA修复基因之前已被证明在衰老黑素细胞中被抑制表达[16]。也有研究发现衰老细胞外泌体所携带的干扰素诱导的跨膜蛋白3（IFITM3）是将衰老信号传递给正常细胞的部分原因[17]。还有学者认为循环外泌体携带的C24：1神经酰胺很有可能直接导致细胞非自主衰老[18]。

    除去外泌体传递信息的作用，其本身的分泌也是维持细胞年轻态的机制之一。如果外泌体的分泌被抑制，核DNA将在细胞质中积累，继而细胞质DNA传感机制激活，活性氧依赖的DDR发生，正常人体细胞则进入衰老样细胞周期阻滞或凋亡[19]。

    3? 外泌体皮肤年轻化作用的转化

    外泌体年轻化作用的转化应用目前处于实验室研究阶段，并未见明确的临床使用报道，但其巨大的应用潜力值得关注：外泌体作为细胞间的通讯物质，一般能取得比药物更好的效果;与细胞本身应用相比，效果基本相同，且应用具有更大的优势[8]：①避免了非自体细胞应用的免疫排斥问题;②更易保存，不存在长时间保存后的毒性，且不丧失活性;③在受控的实验室条件下，通过定制的细胞系进行经济的批量生产。然而，外泌体的来源、产量及质量，外泌体衍生产品开发相关的技术，是限制其进一步应用的重要原因。一些新的研究成果为大家能够尽早临床使用外泌体带来希望。

    3.1 一项研究比较了分别来自三维球体（3D-HDF-XOs）和单层培养的HDFs外泌体：3D-HDF-XOs显著表达了更高水平的TIMP-1，使MMP-1表达下降明显，并使I型前胶原蛋白表达增加。此外，其真皮胶原沉积水平显示高于骨髓间充质干细胞源性外泌体。这些结果提示3D-HDF-XOs具有良好的预防和治疗皮肤衰老的潜力[20]。

    有研究通过使用孔径不断减小的膜过滤器连续挤压IPSC来生成细胞工程纳米囊泡（CENVs），并发现IPSC-CENVs表现出与IPSC-EXO相似的特性，且产量显著提高。IPSC-CENVs处理显著降低了衰老HDFs中与衰老相关的SA-BETA-GAL活性，并抑制了p53和p21的高表达，这是参与细胞周期阻滞、凋亡和细胞衰老信号通路的关键因素。从中可得，IPSC-CENVs可以作为IPSC-EXO的一个极好的替代方案，并可作为治疗皮肤老化药物的一种来源[21]。

    3.2 有研究显示人脐血来源的间充質干细胞外泌体在人体皮肤组织上3h后逐渐接近表皮最外层，18h后逐渐接近表皮，处理3d后，I型胶原蛋白和弹力蛋白的表达增加。此结果提示了外泌体具有与化妆品或药物相结合的潜力[22]。但皮肤表面局部使用外泌体会由于汗水或泪水而被迅速清除。生物可降解或高孔隙水凝胶已被用来承载外泌体并提供持续治疗效果。水凝胶还可以防止外泌体过早被清除，并且，水凝胶可直接放置在靶区或接近靶区，如此外泌体的剂量更集中、更有针对性。但现在封装干细胞来源外泌体的技术研究仍处于早期阶段，还存在许多问题，例如：制作水凝胶的原料—交联剂所具有的毒性，水凝胶对温度及pH的敏感性使得水凝胶易凝固从而无法用于注射，外泌体的体内动力释放谱无法明确等[23]。

    3.3 人工囊泡的概念已被提出：通过化学反应设计并将靶向配体插入囊泡表面，使囊泡具有所需的靶向能力;同时携带和转移所需的生物活性物质，如治疗性miRNA，靶向到目标细胞[24-25]。目前该策略的巨大潜力已在癌症、神经退行性疾病及炎症方面等得到认可，但仍处于发展早期阶段[26]。待其技术发展成熟后，不失为外泌体抗皮肤衰老应用的另一策略。

    4? 小结

    综上所述，外泌体显示出在临床应用于皮肤年轻化治疗中的重大潜力，不但能改善我们的外观，更能在一定程度上阻碍皮肤疾病的发展。目前将其应用于皮肤年轻化实践的想法尚未得到广泛关注，仍需要我们去探究其中的活性成分，分析其作用机制，为外泌体的应用提供坚实有效的基础。

    [參考文献]

    [1]Kalra H，Drummen GP，Mathivanan S.Focus on extracellular vesicles： introducing the next small big thing[J].Int J Mol Sci，2016，17（2）：170.

    [2]Zhang Y，Kim MS，Jia B，et al.Hypothalamic stem cells control ageing speed partly through exosomal miRNAs[J].Nature，2017，548（7665）：52-57.

    [3]Terlecki-Zaniewicz L，Ingo L?mmermann，Latreille J，et al.Small extracellular vesicles and their miRNA cargo are anti-apoptotic members of the senescence-associated secretory phenotype[J].Aging （Albany NY），2018，10（5）：1103-1132.

    [4]Myeongsik O，Jinhee L，Yu K，et al.Exosomes derived from human induced pluripotent stem cells ameliorate the aging of skin fibroblasts[J].Int J Mol Sci，2018，19（6）：1715.

    [5]Choi JS，Cho WL，Choi YJ，et al.Functional recovery in photo-damaged human dermal fibroblasts by human adipose-derived stem cell extracellular vesicles[J].J Extracell Vesicles，2019，8（1）：1565885.

    [6]Shin KO，Ha DH，Kim JO，et al.Exosomes from human adipose tissue-derived mesenchymal stem cells promote epidermal barrier repair by inducing de novo synthesis of ceramides in atopic dermatitis[J].Cells，2020，9（3）：680.

    [7]Koichiro W，Yasuaki I，Yumi K，et al.Functional similarities of microRNAs across different types of tissue stem cells in aging[J].Inflamm Regen，2018，38：9.

    [8]Senquan Liu，Vasiliki Mahairaki，Hao Bai，et al.Highly purified human extracellular vesicles produced by stem cells alleviate aging cellular phenotypes of senescent human cells[J].Stem Cells，2019，37（6）：779-790.

    [9]Zhang Y，Xu J，Liuet S，et al.Embryonic stem cell-derived extracellular vesicles enhance the therapeutic effect of mesenchymal stem cells[J].Int J Mol Sci，2019，9（23）：6976-6990.

    [10]R?ck K，Tigges J，SassS，et al.miR-23a-3p causes cellular senescence by targeting hyaluronan synthase 2： possible implication for skin aging[J].J Invest Dermatol，2015，135（2）：369-377.

    [11]Terlecki-Zaniewicz L，Pils V，Bobbili MR，et al.Extracellular vesicles in human skin： cross-talk from senescent fibroblasts to keratinocytes by miRNAs[J].J Invest Dermatol，2019，139（12）：2425-2436.e5.

    [12]Choi EJ，Kil IS，Cho EG.Extracellular vesicles derived from senescent fibroblasts attenuate the dermal effect on keratinocyte differentiation[J].Int J Mol Sci，2020，21（3）：1022.

    [13]Olivieri F，Albertini MC，Orciani M，et al.DNA damage response （DDR） and senescence： shuttled inflamma-miRNAs on the stage of inflamm-aging[J].Oncotarget，2015，6（34）：35509-35521.

    [14]Prattichizzo F，Micolucci L，Cricca M，et al.Exosome-based immunomodulation during aging：A nano-perspective on inflamm-aging[J].Mech Ageing Dev，2017，168：44-53.