金黄色葡萄球菌β溶血素研究进展
诸葛石养 苏爱荣 黄彦 李秀桂
【关键词】 金黄色葡萄球菌;溶血素;分子特征
中图分类号：R378.1+ 文献标志码： DOI：10.3969/j.issn.10031383.2021.06.014
溶血素作為金黄色葡萄球菌分泌的胞外毒素之一，是造成医院和社区获得性感染重要的致病因子[1]。根据抗原性不同可分为α、β、γ和δ溶血素四种类型，β溶血素能引起人类皮肤黏膜化脓性感染、慢性骨髓炎[2]、感染性肺炎，以及动物眼角膜炎[3]和乳腺炎[4]等。β溶血素的相关研究目前国内报道相对较少，为了给同行学者研究提供理论参考，本文对金黄色葡萄球菌β溶血素的分子结构、生化特性、致病作用及免疫预防等方面进行综述。
1 分子结构
1935年GLENNY和 STEVENS首次发现一种不同于α溶血素的酯酶类毒素，1989年PROJAN正式公开了其完整的基因序列，并命名为β溶血素。β溶血素由330个氨基酸和1个终止子组成的单链多肽分子，其N末端为Glu Ser Lys Lys Asp Asp Thr Asp Leu Lys，起始1～34位氨基酸为一段信号肽，全长约993 bp，相对分子量约为37 kDA。β溶血素为四层三明治结构，富含无规则卷曲，中心含有两个β折叠片和四个α螺旋[5]，其中β折叠结构含量最少为18.8%，α螺旋结构含量是21.8%。β溶血素其中一个β折叠片上的两条β折叠股形成的独特结构与DNaseⅠ超家族成员有高度同源性，因此本质上隶属DNaseⅠ超家族。
2 生化特性β溶血素在低温条件下较为稳定，4℃可以保存3天，冻干后4℃能保存长达4个月。对胰蛋白酶较为敏感，对福尔马林有一定的耐受作用，pH为5.5时β溶血素的活性最高。β溶血素在细菌对数生长期早期合成速度最快，一般24小时达到峰值。聚β羟基丁酸酯和齐墩果酸对β溶血素活性均有明显抑制作用[6]。在培养过程中加入10%～25%CO2能提高β溶血素活性[7]。β溶血素活性具有细胞和物种的特异性[8]，对绵羊、牛和山羊红细胞最为敏感，豚鼠、马、大白鼠、小白鼠和禽类红细胞对β溶血素均不敏感，而对家兔、人、猪和猫红细胞则次之。β溶血素对哺乳动物的红细胞敏感性高低与细胞膜神经鞘磷脂的含量呈正相关，对单核细胞的敏感性均大于淋巴细胞、粒细胞和纤维母细胞[9]。
3 致病机制β溶血素除了传统的溶血功能之外，还有其他多种生物学功能，比如白细胞毒性、促进生物膜形成、抑制初始免疫反应、引发细胞坏死或凋亡和诱发肺部感染等[10]。
3.1 溶血功能
与α、γ和δ三种成孔溶血素完全不同，β溶血素损伤细胞膜并不形成孔道[11]。它是一种依赖Mg2+的中性神经鞘磷脂酶，具有磷脂酶C和鞘磷脂酶活性，水解卵磷脂产生带电荷的磷脂酰基团和非极性二酰甘油，水解鞘磷脂产生磷酸胆碱和神经酰胺，这些产物能损伤红细胞膜，引起溶酶体膜通透性增加，大量水解酶释放至胞浆，通过剪切下游信号分子引发红细胞裂解[12]。在Mg2+协同作用下，β溶血素在体外培养能产生独特的“热冷效应”，即首先进行一段时间37℃培养，红细胞膜形态未发生任何改变，再继续进行一段时间4℃低温培养后，红细胞膜表面就会形成内陷，甚至可能会出现部分或全部膜瓦解的状态，表明β溶血素在低温条件下溶血活性显著提高，溶血能力也较α、γ和δ溶血素弱[13]。有研究显示将β溶血素149或287位的组氨酸突变为天冬酰胺时，其溶血活性则完全消失[14]。
3.2 白细胞毒性
神经鞘磷脂是细胞生物膜的重要组成部分，人白细胞膜的神经鞘磷脂含量占磷脂总量的10%～15%，研究显示β溶血素具有较强的白细胞毒性。SALGADOPABON等[15]研究表明，浓度为1 ng/mL的β溶血素在体外“冷热”培养可以导致大约325个中性粒细胞和淋巴细胞完全溶解，显微电镜扫描显示白细胞膜丧失了表面皱褶，并呈现细胞膜塌陷或整体瓦解。KRUSE等[16]发现β溶血素的一个疏水性β折叠发夹结构为溶解淋巴细胞作用的活性部位，将其第152或289位的组氨酸突变为天冬酰胺后，淋巴细胞毒性作用则完全消失。CHEN等[17]报道β溶血素作用于单核细胞后能够迅速诱导IL1β的表达增加，导致IL6受体和脂多糖受体脱落，最终裂解单核细胞。BHAGWAT等[18]在进行金黄色葡萄球菌（β溶血素阳性株）与T细胞共同孵育时发现，T细胞的平均存活率显著降低，β溶血素阳性株和β溶血素阴性株的T细胞平均存活率分别为33.00%和82.55%，两者差异有统计学意义，表明β溶血素对T细胞具有明显的毒性作用。
3.3 抑制初始免疫反应
β溶血素通过抑制局部单核巨噬细胞或其他辅佐细胞的吞噬和处理，使抗原不能以有效的方式（与MHCⅡ类分子结合）递呈给TH细胞来达到抑制初始免疫反应的目的。JUNG等[19]报道β溶血素水解人内皮细胞膜上的鞘磷脂产生神经酰胺。神经酰胺作为第二信使分子则启动胞内相关的信号通路，阻断表皮生长因子受体来抑制ERK1/2的磷酸化，进而破坏下游信号通路，降低IL8转录水平，导致IL8分泌减少。IL8作为中性粒细胞的趋化剂，IL8的分泌减少将导致中性粒细胞向炎症部位迁移受到抑制。HERRETA等[20]还报道β溶血素的水解产物神经酰胺能激活NOD样受体蛋白3（NLRP3），诱导产生大量的半胱氨酸天门冬氨酸酶1（Caspase1）。Caspase1能阻断IL1β前体和IL18前体形成具有活性效应的IL1β和IL18，从而抑制粒细胞浓集释放炎症因子，进而降低初始免疫反应。
3.4 促进生物定植
生物膜是由细胞外基质包裹的微生物群落，大约80%的细菌感染都与生物膜的形成有关。金黄色葡萄球菌极易黏附在皮肤黏膜、医疗导管和植入式医疗耗材表面形成牢固的生物膜，抵御宿主防御机制的攻击[21]。β溶血素具有生物膜连接酶活性[22]，诱导形成共价核蛋白复合物，通过损伤皮肤黏膜上皮细胞和促进生物膜形成方式在其定植过程中发挥关键作用。
KATAYAMA等在小鼠耳部皮肤定植模型中发现，表达β溶血素的MW2菌株（φSa3缺失）比野生型MW2菌株的定植效率高出50倍以上，进一步研究显示β溶血素在潜伏期内就对人类角质形成细胞具有显著的细胞毒性，有利于金黄色葡萄球菌在皮肤黏膜表面定植[23]。MELNIK[24]报道携带完整β溶血素基因的金黄色葡萄球菌（φSa3丢失）在人鼻腔黏膜定植持续高达14天，而携带φSa3菌株持续定植仅有3天。PHUONG等[25]在兔子感染性心内膜炎模型中证实，表达β溶血素的MW2菌株（φSa3丢失）在H2O2氧化应激诱导下可以诱导Cid基因转录，增加胞外DNA含量，最终促进主动脉内皮细胞生物膜形成。HUSEBY等[26]将β溶血素与DNA共同孵育时，β溶血素并未表达明显的核酸酶活性，而是与单链或双链DNA形成自身共价交联，产生不溶性的核蛋白基质，形成较为牢靠的生物膜骨架。金黄色葡萄球菌COL（hlb+）在流动池中形成的生物膜比金黄色葡萄球菌COL（hlb）更快和更厚，而在兔主动脉中形成明显的生物膜，平均重量（220±34）mg，细菌数为log108.28±0.26，4天后生物膜几乎完全阻塞了整条主动脉，而金黄色葡萄球菌COL（hlb）形成生物膜平均重量仅为（2.5±4.3）mg，细菌数量只有log106.14±0.22。HERRERA等[8]研究发现β溶血素通过整合素依赖活化诱导血小板聚集，抑制CD40和血管细胞黏附分子1在血管内皮细胞表面表达，以延迟宿主免疫系统的激活，血管内皮细胞表面细菌负荷会增加，从而促进生物膜形成。生物膜形成的多寡与β溶血素浓度的呈正相关。
3.5 细胞坏死或凋亡
坏死是细胞内大分子物质的降解，主要依赖溶酶体破裂后释放的酶类[27]。β溶血素能直接损伤细胞溶酶体，引起半胱氨酸蛋白酶和组织蛋白酶B释放，激活NLRP3炎性小体[28]，并诱导细胞坏死。凋亡是细胞程序性死亡，为DNA内源性内切酶作用下被裂解。β溶血素水解靶鞘磷脂产生神经酰胺能激活Caspase3。作为一种蛋白酶，Caspase3属于细胞凋亡中心环节的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶家族中的下游效应者。Caspase3被活化后产生凋亡蛋白酶的级联反应，细胞内的炎性蛋白酶被激活，NFκB、IL1β、1L18等炎症因子的表达增多，进而降解细胞内的重要蛋白质，最终引起细胞不可逆凋亡[29]。
4 免疫预防金黄色葡萄球菌β溶血素是造成奶牛乳腺炎流行的重要因子，导致牛奶产量和质量的降低，給奶牛产业带来巨大的经济损失。基于疫苗高效、安全和经济的特点，奶牛乳腺炎疫苗受到国内外学者的广泛重视。目前国内外均有相关的β溶血素疫苗研究报道，但至今尚未能普及应用。魏春梅[30]利用牛源性重组β溶血素亚单位疫苗治疗由金黄色葡萄球菌菌株Newbould305诱导的乳腺炎，结果显示其能诱导小鼠机体IL6分泌增加，减少乳腺内细菌感染的数量，并能在一定程度上将感染病灶局限化。李光超[31]将纯化β溶血素和pcDNA3.1HisBhlb质粒分别与福氏佐剂乳化混合制成亚单位疫苗和DNA疫苗，强化免疫小鼠10天后，实验组IgG水平和IL2浓度均显著高于对照组，亚单位疫苗对小鼠乳腺细胞的保护作用要明显强于pcDNA3.1HisBhlbDNA疫苗。管玉等人[32]通过构建原核表达质粒pET32ahlb，并在大肠杆菌BL21 （DE3）中诱导表达抗β溶血素单链抗体，结果显示抗β溶血素单链抗体可以显著抑制重组hlb蛋白和金色葡萄球菌的溶血作用。AQIB等[33]利用骆驼亚临床乳腺炎中回收具有β溶血素特性金黄色葡萄球菌，制备成灭活铝沉淀疫苗和油佐剂疫苗，两者产生的最高几何平均滴度分别为37.92和69.92，并且增强剂量疫苗的平均几何滴度明显高于单剂剂量。
5 小结 β溶血素作为一种多功能蛋白在金黄色葡萄球菌致病性和免疫方面发挥着重要作用。尽管前期进行的大量研究工作取得了很大的进展，但依然有相当多的问题还有待解决，包括β溶血素的表达调控、溶血作用的调控途径、乳腺炎疫苗的研制以及引起肺部感染的作用机制等等。进一步深入研究β溶血素一定能为金黄色葡萄球菌相关疾病的治疗提供更为广阔的思路。
参 考 文 献
[1WANG S，KANG O H，KWON D Y.Transcinnamaldehyde exhibits synergy with conventional antibiotic against methicillinresistant Staphylococcus aureus[J].Int J Mol Sci，2021，22（5）：2752.
[2GONZALEZ C D，LEDO C，CELA E，et al.The good side of inflammation：Staphylococcus aureus proteins SpA and Sbi contribute to proper abscess formation and wound healing during skin and soft tissue infections[J].Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis，2019，1865（10）：26572670.
[3JAUNEIKAITE E，FERGUSON T，MOSAVIE M，et al.Staphylococcus aureus colonization and acquisition of skin and soft tissue infection among Royal Marines recruits：a prospective cohort study[J].Clin Microbiol Infect，2020，26（3）：381.e1381.e6.
[4SOIMALA T，LBKEBECKER A，SCHWARZ S，et al.Occurrence and molecular composition of methicillinresistant Staphylococcus aureus isolated from ocular surfaces of horses presented with ophthalmologic disease[J].Vet Microbiol，2018，222：16.
[5MONTOYA M，GOUAUX E.Betabarrel membrane protein folding and structure viewed through the lens of alphahemolysin[J].Biochim Biophys Acta，2003，1609（1）：1927.
[6ZHOU Y L，GUO Y，SUN X D，et al.Application of oleanolic acid and its analogues in combating pathogenic bacteria in vitro/Vivo by a twopronged strategy of βlactamases and hemolysins[J].ACS Omega，2020，5（20）：1142411438.
[7IWATA K，KASUYA K，TAKAYAMA K，et al.Systemic Staphylococcus pseudintermedius infection in an arctic fox （Vulpes lagopus） with severe multifocal suppurative meningoencephalitis and nephritis[J].J Vet Med Sci，2018，80（8）：12191222.
[8HERRERA A，VU B G，STACH C S，et al.Staphylococcus aureus βtoxin mutants are defective in biofilm ligase and sphingomyelinase activity，and causation of infective endocarditis and Sepsis[J].Biochemistry，2016，55（17）：25102517.
[9TAJIMA A，IWASE T，SHINJI H，et al.Inhibition of endothelial interleukin8 production and neutrophil transmigration by Staphylococcus aureus betahemolysin[J].Infect Immun，2009，77（1）：327334.
[10SOHAIL M，RAFIQ A，NAEEM M，et al.Effects of different types of microbes on blood cells， current perspectives and future directions[J]. Saudi J Med Pharm Sci， 2021， 7（1）：16.
[11PAKDEESIRIWONG N， RANGDIST S， CHUMKIEW S， et al. Hemolytic activity inhibition of staphylococcus aureus hemolysins by secreted molecules from enterococcus faecalis strains R1， R3， and R7[J]. International Virtual Conference on Science and Technology， 2020， 8（2）：450455.
[12VANDENESCH F，LINA G，HENRY T.Staphylococcus aureus hemolysins，bicomponent leukocidins，and cytolytic peptides：a redundant arsenal of membranedamaging virulence factors？[J].Front Cell Infect Microbiol，2012，2：12.
[13BAGBAN M，JAIN N K.Comparative analysis of αhemolysin and βhemolysin by hplc and ftir[J].Int J Sci Res，2018，7（6）：345.
[14TAKEDA K，TANAKA Y，KANEKO J.The Nterminal aminolatch region of Hlg2 component of staphylococcal bicomponent γhaemolysin is dispensable for prestem release to form βbarrel pores[J].J Biochem，2020，168（4）：349354.
[15SALGADOPABN W，HERRERA A，VU B G，et al.Staphylococcus aureus βtoxin production is common in strains with the βtoxin gene inactivated by bacteriophage[J].J Infect Dis，2014，210（5）：784792.
[16KRUSE A C，HUSEBY M J，SHI K，et al.Structure of a mutant β toxin from Staphylococcus aureus reveals domain swapping and conformational flexibility[J].Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun，2011，67（Pt 4）：438441.
[17CHEN L，WEI Y D，ZHAO S M，et al.Antitumor and immunomodulatory activities of total flavonoids extract from persimmon leaves in H22 liver tumorbearing mice[J].Sci Rep，2018，8（1）：10523.
[18BHAGWAT A，COLLINS C H，DORDICK J S.Selective antimicrobial activity of cell lytic enzymes in a bacterial consortium[J].Appl Microbiol Biotechnol，2019，103（17）：70417054.
[19JUNG P，ABDELBARY M M，KRAUSHAAR B，et al.Impact of bacteriophage Saint3 carriage on the immune evasion capacity and hemolytic potential of Staphylococcus aureus CC398[J].Vet Microbiol，2017，200：4651.
[20HERRERA A，KULHANKOVA K，SONKAR V K，et al.Staphylococcal βtoxin modulates human aortic endothelial cell and platelet function through sphingomyelinase and biofilm ligase activities[J].mBio，2017，8（2）：e00273e00217.
[21BANIMUSLEM T A. Impact of subminimal inhibitory concentrations of ciprofloxacin， amikacin and gentamicin on the production of staphylococcus aureus βtoxin the biofilm ligase[J]. Journal of Global Pharma Technolog， 2019，11（7Suppl.）：229236.
[22YONG Y Y，ONG M W K，DYKES G，et al.Betacyanininhibited biofilm formation of coculture of Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa on different polymer surfaces[J].FEMS Microbiol Lett，2021，368（1）：fnaa214.
[23KATAYAMA Y，BABA T，SEKINE M，et al.Betahemolysin promotes skin colonization by Staphylococcus aureus[J].J Bacteriol，2013，195（6）：11941203.
[24MELNIK B C.Olumacostat glasaretil，a promising topical sebumsuppressing agent that affects all major pathogenic factors of acne vulgaris[J].J Invest Dermatol，2017，137（7）：14051408.
[25TRAN P M， EEISS M， KINMEY K J， et al. φSa3 mw prophage as a molecular regulatory switch of staphylococcus aureus βtoxin production[J]. Journal of bacteriology， 2019， 201（14）：766718.
[26HUSEBY M J，KRUSE A C，DIGRE J，et al.Beta toxin catalyzes formation of nucleoprotein matrix in staphylococcal biofilms[J].Proc Natl Acad Sci USA，2010，107（32）：1440714412.
[27MUOZPLANILLO R，FRANCHI L，MILLER L S，et al.A critical role for hemolysins and bacterial lipoproteins in Staphylococcus aureusinduced activation of the Nlrp3 inflammasome[J].J Immunol，2009，183（6）：39423948.
[28GUPTA R，GHOSH S，MONKS B，et al.RNA and βhemolysin of group B Streptococcus induce interleukin1β （IL1β） by activating NLRP3 inflammasomes in mouse macrophages[J].J Biol Chem，2014，289（20）：1370113705.
[29THAPA A， ADAMIAK M， BUJKO K， et al. Dangerassociated molecular pattern molecules take unexpectedly a central stage in NLRP3 inflammasomecaspase1mediated trafficking of hematopoietic stem/progenitor cells[J]. Leukemia， 2021.[Online ahead of print].
[30魏春梅.牛源性重組金黄色葡萄球菌β溶血素亚单位疫苗对金黄色葡萄球菌诱导的乳腺内感染小鼠的保护研究[D].雅安：四川农业大学，2010.
[31李光超.牛源金黄色葡萄球菌β溶血素的真核表达及免疫保护效果评价[D].兰州：甘肃农业大学，2016.
[32管玉，王曼，张蕾，等.牛源抗金黄色葡萄球菌β溶血素单链抗体的鉴定及其生物学特性[J].畜牧与兽医，2020，52（4）：9197.
[33AQIB A I，ANJUM A A，IJAZ M，et al.Development and evaluation of vaccine against Staphylococcus aureus recovered from naturally occurring mastitis in shecamels[J].Microb Pathog，2018，117：341347.
（收稿日期：2021-03-03 修回日期：2021-03-30）
（编辑：潘明志）
