基于黄酮醇类半胱氨酸荧光探针的设计、合成及性能研究

    曹小燕 路宏朝 张强 任传清 刘建利

    

    

    

    摘 要 以丹皮酚和糠醛为原料,黄酮醇为荧光团,丙烯酸酯为识别基团,设计并合成了一种黄酮醇类半胱氨酸荧光探针2-(2-呋喃基)-7-甲氧基色酮-3-丙烯酸酯(HFAC),采用核磁共振(1H NMR、13C NMR )和高分辨质谱(HRMS-ESI)确证其结构。吸收光谱和发射光谱结果表明,探针HFAC对半胱氨酸(Cys)具有高效的检测识别能力。同时,荧光实验证实了探针HFAC是一种“关-开”型荧光探针,525 nm处的荧光强度与Cys浓度在20~400 μmol/L范围内呈良好的线性关系,线性方程为y=0.4608x + 3.994(R2=0.9987),检出限为379 nmol/L,并在365 nm紫外光下发出亮绿色荧光。A549细胞荧光成像实验表明,探针HFAC具有低毒性、良好的细胞膜通透性和生物相容性,具有快速检测细胞内/外源生物硫醇Cys的能力。

    关键词 黄酮醇; 半胱氨酸; 荧光探针; 细胞成像

    1 引 言

    细胞内生物硫醇主要包括半胱氨酸(Cys)、高半胱氨酸(Hcy)和谷胱甘肽(GSH)等,在维持机体的正常生理活动中发挥了重要作用,如调解生物体内的氧化还原平衡、维持生物体内正常生命活动和预防疾病等[1~5]。生物硫醇浓度异常,易引起一系列疾病,如心脏病、肝损伤、癌症、骨质疏松症、肠道炎症及心血管疾病等[6,7]。Cys是细胞内含量丰富的含有巯基的氨基酸(30~200 μmol/L),在蛋白质的合成、解毒、代谢和翻译后修饰等方面发挥重要作用[8]; 若机体内Cys缺失,易引发多种疾病,如生长发育缓慢、皮肤损伤、身体虚弱、肝损伤、嗜睡、头发褪色、癌症等疾病[9]。因此,在生理条件下,对Cys进行实时、高效、准确的定量检测,在疾病早期诊断和生化研究中具有重要意义。

    传统生物硫醇的分析方法,如高效液相色谱(HPLC)[10]、傅里叶变换红外(FTIR)光谱[11]、质谱(MS)[12]、电化学分析[13]和紫外/可见光谱分析[14]等,存在操作繁琐、耗时长或设备昂贵等不足。与传统分析法相比,荧光分析法具有操作简单、便捷、灵敏度好、选择性高等优点[15]。由荧光团和识别基团构筑的荧光探针,不但具有高灵敏度,还具有实时、高效和原位检测等特点[16,17]。近十年来,文献报道了一系列用于选择性检测Cys的荧光探针,其设计策略是基于巯基的强亲核性,利用Cys的巯基与探针分子的识别基团发生磺酸酯键裂解[18]、磺酰胺断裂[19]、迈克尔加成[20]、二硫键断裂[21]、醛基或丙烯酸酯加成环化反应[22,23]等,依据反应前后荧光信号的变化,检测Cys的含量。然而,已经报道的Cys荧光探针部分具有结构复杂、检测耗时较长、检测选择性或灵敏度较差等问题。因此,设计合成能够选择性检测3种硫醇(Cys、Hcy和GSH),具有较低的细胞毒性、较高的生物相容性和细胞膜通透性的荧光探针,实现硫醇与探针的快速响应,具有重要的研究价值。

    3-羟基黄酮类化合物如槲皮素和山奈酚,是一类具有抗氧化、抗炎和抗癌活性的天然产物,可见光激发下可发生激发态分子内质子转移(ESIPT)染料,具有优良的光化学和光物理学性质,广泛应用于金属离子(阳离子或阴离子)和小分子物质的特异识别及生物成像研究[24~28]。Ren等[29]将丙烯酸吡啶基團引入探针的识别部位,对Cys具有较高的灵敏度和选择性,检出限为0.48 μmol/L。Li等[30]在3-羟基黄酮的2位引入噻吩基团,基于ESIPT机理,在生理条件下实现了对Cys的选择性检测,检出限为42.3 nmol/L。因此,本研究基于3-羟基黄酮的荧光特性,2位引入呋喃杂环拓展荧光母核的共轭结构,3位引入丙烯酸酯作为荧光淬灭基团和识别部位,设计、合成了探针2-(2-呋喃基)-7-甲氧基色酮-3-丙烯酸酯(HFAC)。基于3-羟基黄酮的羰基和羟基的邻近,能形成分子内氢键,易于发生激发态分子内质子转移(ESIPT)机制,赋予其优异的荧光性能,实现水溶液体系中对Cys的选择性识别和细胞成像研究,为生物体内Cys的选择性检测提供实验基础。

    2 实验部分

    2.1 仪器与试剂

    UV-2600紫外可见分光光度计(日本岛津公司); Cary Eclipse荧光分光光度计(美国安捷伦公司); DRX-600核磁共振波谱仪(德国Bruker公司); Bruker microTOF-Q II 高分辨质谱仪(德国道尔顿公司); IX73倒置荧光显微镜(日本奥林巴斯株式会社)。全部化合物紫外-可见吸收光谱和荧光发射光谱的测定均于室温下进行。 TLC为自制硅胶板; 柱色谱分离硅胶(200~300目,青岛海洋公司)。

    所用试剂均为国产分析纯(阿拉丁试剂公司); 实验用水为超纯水。

    2.2 荧光探针的合成

    探针2-(2-呋喃基)-7-甲氧基色酮-3-丙烯酸酯(HFAC)的合成路线如图1所示。

    2.2.1 2-(2-呋喃基)-3-羟基-7-甲氧基色酮(1)的合成 参考文献[31]的方法,将192 mg 2-呋喃甲醛(2 mmol)溶于10 mL乙醇中,加入415.2 mg丹皮酚(2.5 mmol)和10 mL 1 mol/L NaOH溶液,反应混合物于50℃下搅拌6 h后,反应液倾入30 mL冰水中,以1 mol/L HCl调节至中性。减压抽滤、洗涤得到黄色固体沉淀物。黄色固体干燥后无需纯化,加入15 mL乙醇和10 mL 1 mol/L NaOH 溶液,0℃下搅拌反应30 min后,慢慢滴加30% H2O2(1 mL),并继续搅拌30 min,室温搅拌过夜。反应液中缓慢滴加1 mol/L HCl,调节溶液至中性,固体沉淀物经减压抽滤、冷水冲洗,用无水乙醇重结晶,得到化合物1(0.32 g, 62%)。1H NMR (600 MHz, CDCl3) δ (ppm): 8.11 (d, J= 9.4 Hz, 1H), 7.67 (s, 1H), 6.97 (s, 2H), 6.87 (s, 1H), 6.63 (s, 1H),3.91 (s, 3H)。13C NMR (150 MHz, CDCl3) δ(ppm): 172.06, 164.45, 157.17, 144.67, 144.61, 138.40, 136.35, 126.88, 115.26, 115.19, 115.17, 112.83, 100.20, 77.44, 77.23, 77.02, 56.11。HRMS(ESI) m/z calcd. for C14H10O5 (M + Na)+: 281.0528; Found: 281.0420。

    2.2.2 探针2-(2-呋喃基)-7-甲氧基色酮-3-丙烯酸酯(HFAC)的合成[31] 将化合物1(0.258 g)溶于20 mL二氯甲烷溶液中,在冰浴条件下,缓慢滴加0.5 mL三乙胺,滴加完毕后,继续搅拌30 min; 再滴加丙烯酰氯(0.24 mL)的二氯甲烷溶液(10 mL),继续在冰水浴条件下搅拌1 h,缓慢恢复至室温,搅拌4 h,采用TLC检测反应完全后,缓慢滴加10 mL水淬灭反应,用二氯甲烷萃取,无水Na2SO4干燥,减压浓缩柱层析分离(石油醚-乙酸乙酯(1∶2,V/V)),得到灰白色粉末0.172 g,产率为55%。1HNMR (600 MHz, CDCl3) δ (ppm): 8.12 (d, J= 8.8 Hz, 1H), 7.64 (s, 1H), 7.09 (s, 1H), 6.99~6.86 (m, 2H), 6.70 (d, J= 17.3 Hz, 1H), 6.58 (s, 1H), 6.45 (d, J= 17.3 Hz, 10.5 Hz, H), 6.10 (d, J=10.3 Hz, 1H), 3.91 (s, 3H)。 13C NMR (150 MHz, CDCl3) δ(ppm): 171.24, 164.63, 163.19, 157.11, 147.62, 146.00, 144.16, 133.92, 131.25, 127.61, 127.23, 117.76, 115.89, 114.97, 112.70, 100.42, 77.44, 77.23, 77.02, 56.13。HRMS(ESI) m/z calcd. for C17H12O6 (M + Na)+: 335.0634; Found: 335.0526。

    2.3 紫外-可见吸收光谱和荧光光谱的测定

    准确称取1.65 mg探针HFAC溶于DMSO中,配成1.0 mmol/L的母液,4℃冷藏保存, 备用。各种氨基酸溶于水中,配制成1.0 mmol/L的母液,备用。测定光谱时,用磷酸盐缓冲溶液-乙腈(4∶6,V/V,pH 7.4)将探针HFAC储备液稀释至20.0 μmol/L,分别加入400.0 μmol/L不同的氨基酸溶液,在室温条件下, 测定荧光光谱和紫外-可见吸收光谱。采用相同的稀释方法,测定探针HFAC与不同浓度氨基酸的荧光光谱, 激发和发射狭缝均为5 nm。

    2.4 细胞毒性实验

    以A549细胞为模型,采用3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)法[32],考察探针HFAC的细胞毒性。将A549细胞(3 × 104 cell)接种于96孔板,每孔加入200 μL培养基(DMEM含10%胎牛血清),在5% CO2、37℃培养箱培养24 h,待细胞充分贴壁,然后换液,加入90 μL新的培养基和10 μL不同浓度的探针HFAC(0~50 μmol/L),继续培养24 h后,弃去培养基,加入110 μL新鲜培养基(含10 μL MTT,5 mg/mL),继续培养4 h后,弃去培养基,加入100 μL DMSO,振荡10 min。用酶标仪测定各孔570 nm下的OD值,依据公式(1)计算探针HFAC的细胞毒性。

    Cell viability(%) =[(ODExp-ODBlank)/(ODControl-ODBlank)] × 100 (1)

    2.5 细胞荧光成像

    依据文献[33]的方法,将A549细胞(3 × 105)接种于6孔板中,于5% CO2、37℃培养箱培养24 h。弃去培养基,细胞用PBS洗涤3次,分别加入无血清培养基,分4组:(1)对照组 A549细胞与PBS共孵育30 min; (2)药物组 A549细胞与探针HFAC(20 μmol/L)共孵育30 min; (3)抑制剂组 A549细胞与N-乙基马来酰亚胺(NEM,1.0 mmol/L)共孵育30 min后,再加入探针HFAC(20 μmol/L)共孵育30 min; (4)Cys组 A549细胞与N-乙基马来酰亚胺(NEM,1.0 mmol/L)共孵育30 min后,再加入Cys(100或 200 μmol/L)共孵育30 min,继续加入探针HFAC(20 μmol/L)孵育30 min。孵育后的细胞用PBS洗涤3次, 在荧光倒置显微镜下观察细胞成像。

    3 结果与讨论

    3.1 探针HFAC的紫外-可见吸收光谱和荧光发射光谱

    依据文献[31]方法合成了探针HFAC,通过核磁共振氢谱(1H NMR)、碳谱(13C NMR)和高分辨质谱(HRMS-ESI)对结构进行了表征,结果详见2.2节和电子版文后支持信息图S1~S6。

    采用紫外-可见吸收光谱考察探针HFAC对Cys的响应情况。如图2A所示,探针HFAC最大吸收峰位于330 nm处,加入20倍量Cys后,随着反应时间延长,最大吸收峰明显红移至360 nm,并且强度逐渐增强,等吸光点为345 nm。在激發波长360 nm时,探针没有荧光信号(图2B); 随着生物硫醇(Cys、Hcy和GSH等)的加入,反应体系在525 nm处出现荧光峰,且荧光强度变化差异显著。探针HFAC加入Cys后,随着反应时间延长,525 nm处荧光强度迅速增强(图3A),在0~10 min内呈现良好的线性关系(y=19.92x + 20.26, R2= 0.9950),20 min后达到最大值(图3B),溶液在365 nm紫外光下发出强烈的亮绿色荧光(图2B插图)。探针HFAC加入Hcy后,引起525 nm处荧光强度变化较弱; GSH及其它硫醇类化合物的荧光信号未出现明显改变(图2B和3B)。光谱信号变化说明,探针HFAC具有良好的光稳定性,与Cys作用前后展现了荧光的“关-开”过程,有利于Cys的选择性荧光检测,斯托克位移为165 nm。

    3.2 探针HFAC对Cys的检测性能

    进一步考察了不同浓度的Cys对探针HFAC检测性能的影响。由图4A可知, Cys浓度在20~400 μmol/L范围内与探针在525 nm处HFAC的荧光强度呈良好的线性关系,线性方程为y=0.4608x + 3.994(R2=0.9987)(图4B), 检出限(S/N=3)为37.9 nmol/L,远低于生物体内Cys的含量(30~200 μmol/L)[8]。上述实验结果表明,探针HFAC可用于定量检测Cys浓度。

    3.3 探针HFAC的抗干扰能力

    生物体内存在多种含巯基氨基酸,可能对探针HFAC的专一性检测产生干扰。为了评价探针HFAC对Cys响应的特异性,测试了探针HFAC对19种氨基酸的荧光光谱响应。如图5所示,可能干扰的氨基酸与探针HFAC(20 μmol/L)在室温条件下反应30 min后,Tyr、Lle、Trp、Ser、Ala、Asp、Gly、Leu、Phe、His、Lys、Arg、Val、Thr、Glu、Pro、Met和GSH未引起反应液在525 nm处荧光强度的明显改变(图5); 再加入Cys(400 μmol/L),在室温条件下反应10 min后,反应混合液在525 nm处的荧光强度明显增强,并且与对照组近似。但是Hcy(400 μmol/L)与探针HFAC(20 μmol/L)在室温条件下反应30 min后, 525 nm处荧光强度增强了20%; 再加入Cys(400 μmol/L),继续在室温条件下反应10 min后,混合液在525 nm处的荧光强度与对照组相当,表明Hcy对探针HFAC选择性识别Cys存在干扰。为了进一步探索探针HFAC对Cys的高效选择性,借助假一级动力学模型[34],考察探针HFAC识别生物硫醇(Cys、Hcy和GSH)的速率(见电子版文后支持信息图S7)。当生物硫醇(Cys 2 mmol/L、Hcy 2 mmol/L和GSH 4 mmol/L)明显过量时,其一级动力学速率常数分别为2.14 ×103 s1、 3.98 ×104s1和4.23 ×105 s1。上述结果进一步证实, 探针HFAC能够选择性识别Cys,具有较强的专一性,可用于溶液体系中低浓度生物硫醇Cys的选择性检测。

    3.4 pH值和乙腈比例的影响

    考察了pH值及乙腈含量对探针HFAC的稳定性及探针HFAC与Cys响应的影响。探针HFAC与Cys作用前后,525 nm处荧光强度与pH值关系曲线如图6A所示,在pH 3~11范围内,探针HFAC的荧光信号不受溶液pH值的影响; 加入Cys后,反应体系在525 nm处荧光强度随溶液pH值(6~12)的增大而呈现先增后降的趋势; 在pH 7~11范围内,反应液在525 nm处荧光强度达到最大值,变化较弱。考虑到人体生理pH=7.35~7.45,为了方便后续荧光成像研究,选择测试时pH值为7.4。由图6B可知,探针HFAC的荧光信号不受溶液体系中乙腈含量的影响。加入Cys后,反应体系在525 nm处荧光强度随检测溶液中乙腈含量(10%~50%,V/V)的增加而呈现先增加后降低的趋势, 乙腈含量为40%(V/V)时, 525 nm处荧光强度达到最大。本研究选择乙腈-PBS(4∶6,V/V,pH 7.4)为检测介质。

    3.5 探针HFAC与Cys的作用机理

    为了阐明探针HFAC与Cys的作用机理,采用高分辨质谱分析了探针HFAC以及探针HFAC和Cys发生反应后的产物。结果表明,探针HFAC的分子离子峰为m/z 335.0527,在HFAC和过量Cys反应后的质谱图上观察到了m/z 259.0601和122.0270,分别对应黄酮醇化合物1和过量的Cys,已经完全反应(电子版文后支持信息图S5、S6 和S8),推测其反应机理如图7所示。首先Cys和探针HFAC的丙烯酰基的双键发生迈克尔加成反应,随后Cys中的氨基进攻酯基,发生分子内的加成-消除反应,生成羟基黄酮母体化合物1和较稳定七元环化合物。而Hcy和GSH由于其自身分子链较长以及探针羰基的空间位阻效应,阻碍Hcy或GSH与探针HFAC的响应,响应荧光信号较弱或不发荧光,与文献[35]报道一致。

    3.6 探针HFAC的细胞成像实验

    文献[8]已经证实,活细胞内存在大量Cys和GSH,细胞内的浓度分别为30~200 μmol/L和1~10 mmol/L。考察了探针HFAC对A549细胞内Cys的荧光成像能力。首先测定了探针HFAC的细胞毒性。如图8所示,在0~50 μmol/L浓度范围内,探针HFAC对非小细胞肺癌A549细胞未表现出明显的细胞毒性。A549细胞本身无荧光(图9A); 当探针HFAC(20 μmol/L)与A549细胞共孵育30 min,细胞呈现明显的亮绿色荧光(图9B)。为了进一步探究探针HFAC对细胞内生物硫醇Cys的选择性响应,

    选用生物巯基抑制剂NEM(1 mmol/L)[34]与A549细胞预孵育30 min后,再加入探针HFAC孵育30 min,细胞不显示荧光(图9C)。为了验证探针HFAC是否可以在活细胞内对外源引入的Cys进行细胞成像, A549细胞和NEM(1 mmol/L)预孵育30 min,再加入Cys(100 μmol/L或 200 μmol/L)孵育30 min,隨后加入探针HFAC(20 μmol/L)继续孵育30 min,暗场下可见到细胞继续发出明显的亮绿色荧光(图9D和9E),并且与Cys浓度存在相关性。上述实验结果与荧光光谱实验结果一致,表明探针HFAC具有低毒性、良好的生物相容性和细胞膜通透性,可选择性检测细胞内/外的Cys。

    4 结 论

    基于ESIPT机制设计合成了一种新型“关-开”型荧光探针HFAC,并对其结构进行了表征。在生理pH值(pH 7.4)条件下,探针HFAC在乙腈-PBS缓冲溶液体系中能够高灵敏、快速、选择性识别Cys,并具有良好的光稳定性,检出限为37.9 nmol/L,斯托克位移165 nm。此外,探针HFAC具有低毒性、良好的生物相容性和细胞膜通透能力,可用于细胞内/外Cys的选择性检测和荧光成像研究,在生物活性分析方面具有潜在的应用价值。

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    CAO Xiao-Yan*1, LU Hong-Zhao2, ZHANG Qiang1, REN Chuan-Qing1, LIU Jian-Li3

    1(Key Laboratory of Catalysis in Shaanxi Province, Shaanxi University of Technology, Hanzhong 723000, China)

    2(School of Biological Science and Engineering, Shaanxi University of Technology, Hanzhong 723000, China)

    3(Biomedicine Key Laboratory of Shaanxi Province, College of Life Science, Northwest University, Xi′an 710069, China)

    Abstract A highly selective and sensitive fluorescent probe 2-(2-furyl)-7-methoxychromone-3-acrylate (HFAC) was designed and synthesized with paeonol and furfural as raw material, 3-hydroxyflavone as fluorophore and acrylate group as recognition unit. The probe HFAC was characterized by 1H NMR, 13C NMR and HRMS-ESI. The results of absorption and fluorescence spectral analysis indicated that the probe had high sensitivity and selectivity towards cysteine (Cys), and the detection was not affected by other biothiols such as homocysteine, glutathione and others. Meanwhile, it was confirmed that HFAC was a reaction type “off-on” fluorescent probe, the fluorescence intensity at 525 nm had a high linear relationship with Cys concentration in the range of 20-400 μmol/L with a regression equation of y=0.4608x + 3.994 (R2=0.9987) and a detection limit of 37.9 nmol/L, and the color of the reaction solution changed from colorless to bright green at UV light of 365 nm. Fluorescence bioimaging experiment proved that probe HFAC had excellent cell membrane permeability, low cytotoxicity and biocompatibility, which was desirable for fast detection and visualization of both endogenous and exogenous Cys in A549 cells.

    Keywords Flavonol; Cysteine; Fluorescent probe; Bioimaging

    (Received 21 November 2019; accepted 15 May 2020)

    This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (No.21502109) and the Funds of Research Programs of Shaanxi University of Technology (No. SLG1811).

    2019-11-21收稿; 2020-05-15接受

    本文系國家自然科学基金项目(No.21502109)和陕西理工大学校级科研项目(No.SLG1811)资助

    E-mail: ruoshuizhihan@163.com