钙通道阻滞剂对牙龈组织细胞凋亡的影响及相关研究进展

    杨儒壮 张瑜 齐羲明

    [摘要]随着我国高血压患者的增多，钙离子通道阻滞剂越来越多地用于治疗高血压，然而服用钙离子通道阻滞剂后会发生牙龈组织增生。这种牙龈增生不仅影响患者牙龈的健康和美观，还干扰患者高血压的治疗，严重影响了患者的生活质量。因此，为防止钙离子通道阻滞剂介导的牙龈增生（Calcium-channel blockers induced gingival overgrowth，CIGO），对其机制的研究具有一定的临床意义，有研究表明这种增生与牙龈组织细胞的增殖和凋亡平衡被破坏有关，本文对钙离子通道阻滞剂介导牙龈组织细胞凋亡的相关文献进行综述，旨在为未来CIGO的发生机制研究中提供参考。

    [关键词]钙离子通道阻滞剂;牙龈增生;细胞凋亡;Bcl-2基因;microRNAs

    [中图分类号]R781.47? ? [文献标志码]A? ? [文章编号]1008-6455（2020）12-0190-04

    The Effect of Calcium Channel Blockers Induced Apoptosis of Gingival Cells and its Related Research Progress

    YANG Ru-zhuang1， ZHANG Yu2，QI Xi-ming3

    （1.Department of Stomatology，2.Department of Oncology，3.Central Laboratory，Qinhuangdao First Hospital， Qinhuangdao 063000， Hebei，China）

    Abstract： With the increase of patients with hypertension in China， calcium channel blockers are more and more used to treat hypertension. However， gingival overgrowth will occur after taking calcium channel blockers. This kind of gingival overgrowth not only affects the health and beauty of patients' gums， but also interferes with the treatment of hypertension， and seriously affects the quality of life of patients. Therefore， in order to prevent the calcium channel blocker induced gingival overgrowth （CIGO），it is of clinical significance to study the mechanism of CIGO.Some studies have shown that this gingival overgrowth is related to the destruction of the balance between proliferation and apoptosis of gingival cells，In this paper，we reviewed the related literature of calcium channel blockers induced apoptosis of gingival cells，in order to provide a reference for the mechanism of CIGO in the future.

    Key words：calcium channel blocker; gingival overgrowth;cell apoptosis;Bcl-2 gene;microRNAs

    1984年，Lederman[1]报道了第1例硝苯地平（Nifedipine，NIF）介导的药物性牙龈增生，人们开始关注药物性牙龈增生及其发病机制。药物性牙龈增生（Drug-induced gingival overgrowth，DGO）系指服用某种药物后发生的牙龈组织过度生长和牙龈体积增大。引起药物性牙龈增生的药物主要类型有三种：①钙离子通道阻滞剂：如硝苯地平（Nifedipine，NIF）、硫氮卓酮、维拉帕米、氨氯地平和地尔硫卓等[2]，钙离子通道阻滞剂[1]能抑制细胞外钙离子内流，使血管平滑肌细胞内的钙离子减少，引起心肌收缩性降低和血管扩张从而起到降低血压的作用。硝苯地平是目前治疗中老年人顽固性高血压的有效药物，以后虽然出现了氨氯地平，非络地平及尼莫地平等新一代钙离子拮抗剂，但NIF仍然沿用至今，但是NIF容易引起DGO的发生;②免疫抑制剂：如环孢菌素;③抗癫痫药物：如苯妥英钠。

    2005年，我国高血压患者已达1.34亿，其中接受药物治疗者约50%使用钙通道阻滞剂[3]。2015年用于治疗高血压通用的硝苯地平片的全球销售额为12亿美元[4]。由于预计未来10年全球高血压患病率将增加，硝苯地平的使用频率也将同样增加[5]。因此，硝苯地平引起牙龈过度生长的患者数量将继续增加。据报道鈣通道阻滞剂中导致牙龈增生的发病率不同，Miranda 等研究发现硝苯地平30%[6]，地尔硫卓30%，维拉帕米20%[7];而Nakib 等[8]发现硝苯地平42%。而与其他钙通道阻滞剂（如：氨氯地平、地尔硫卓、非洛地平和维拉帕米）相关的发生率约5%。钙离子通道阻滞剂诱导的牙龈增生（Calcium-channel blockers induced gingival overgrowth，CIGO）是指服用某种钙离子通道阻滞剂后发生的牙龈组织过度生长和牙龈体积增大。这种牙龈增生作为药物的副作用，部分患者由于CIGO导致患者不适，影响高血压的治疗。

    随着未来10年全球高血压患病率的增加，硝苯地平的使用也将增加[9]。因此，硝苯地平引起的牙龈过度生长的患病率将继续增加。硝苯地平诱导的牙龈过度生长诱导固有层结缔组织中的细胞生长和细胞外基质ECM的积累，导致上皮增生和拉长[10]，因此，对CIGO的机制研究具有一定的临床意义。

    1? 临床表现和组织病理学表现

    CIGO主要病理表现牙龈组织细胞数量的增多和细胞外基质的大量堆积。基于组织学和组织形态学分析，牙龈过度生长是这些药物的副作用。苯妥英钠诱导的损伤显然是最易纤维化的，环孢素诱导的损伤是高度炎症且表现出很少的纤维化，而硝苯地平诱导的损伤是混合的[11]。

    一般情况下，CIGO牙龈增生多发于上下颌前牙，主要累及牙龈乳头和唇舌侧附着龈，发病时无痛，呈念珠样[12]。而牙龈组织体积的增加主要是由于结缔组织的反应。所有药物种类的病变组织病理学相似，其特征是细胞外基质蛋白（如：胶原或无定形基质）过度积聚。存在不同程度的炎性浸润，而成纤维细胞数量的增加，浸润性炎性细胞以浆细胞为主。角化上皮覆盖结缔组织基质，上皮嵴可深入结缔组织，形成排列不规则的胶原纤维。主要表现为角质化鳞状上皮伴棘皮病和延伸至结缔组织深处的形成管状钉突，棘细胞层明显增厚，管状伸长的上皮钉突深入结缔组织固有层显示胶原纤维化，成纤维细胞多样，血管增多，含有浆细胞和淋巴细胞的炎性细胞浸润，无定形基质和糖胺聚糖增加明显[13-14]。

    2? CIGO中牙齦成纤维细胞增殖和凋亡的平衡遭到破坏

    牙龈成纤维细胞是在牙龈结缔组织中发现的主要细胞类型，负责该组织的维护和修复[15]。牙龈过度生长的原因以前被认为是由于暴露于药物和牙龈组织炎症期间牙龈成纤维细胞的生长增强和凋亡抑制[16-17]。

    Kantarci等[7]发现，在药物引起的各型DGO患者中，牙龈成纤维细胞的程序性细胞死亡率均显著下降。该研究提示，增生牙龈标本中的FOXO1处于失活状态，成纤维细胞可能由于转录因子FOXO1的调控作用而发生程序性细胞死亡抑制。Caspase-3蛋白是诱导程序性细胞死亡的细胞内线粒体信号途径中的关键蛋白，其表达减少则提示成纤维细胞的程序性细胞死亡可能被抑制。任何组织中的成纤维细胞群都是通过平衡细胞增殖和凋亡的细胞周期调节来维持的。细胞周期和凋亡受多种蛋白质的调控，包括细胞周期蛋白依赖性激酶（CDK）、细胞周期蛋白、CDK抑制剂、视网膜母细胞瘤蛋白（RB）、p53、Bcl-2家族蛋白、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶和细胞色素C。Takeuchi等[18]研究发现，使用硝苯地平后，生长期患者的细胞增殖率、DNA和胶原合成率都有增加的趋势。与健康供体的成纤维细胞相比，这些组织在碱性FGF存在下也表现出明显的G1期到S期进入增加。而Takeuchi等在2011年研究发现[19]硝苯地平诱导牙龈过度生长的机制与硝苯地平诱导牙龈过度生长患者成纤维细胞凋亡率降低有关，牙龈过度生长的发病机制包括抑制Bax、caspases（3和9）、p53和细胞色素C的表达下调以及Bcl-2的过度表达介导的牙龈成纤维细胞凋亡受到抑制有关。

    Bcl-2基因（即B细胞淋巴瘤/白血病-2基因）是一种癌基因，防止细胞色素C释放发挥它抑制细胞凋亡的作用[20]。线粒体依赖性凋亡途径是一种凋亡诱导途径。该途径受Bcl-2家族蛋白（包括Bcl-2或Bcl-xl）、caspases、细胞色素C和p53的调控。当细胞色素C从膜完整性受损的线粒体释放到胞浆中时，这一途径被启动。细胞色素C随后招募并切割caspase-9，导致其活化，活化的caspase-9随后切割caspase-3，导致其活化，这些连续的作用导致了细胞凋亡[21-22]。除线粒体介导的凋亡途径外，细胞膜受体介导的凋亡途径是诱导细胞凋亡的另一途径。caspase-2和caspase-8通过细胞膜受体介导的途径被激活[23]。细胞色素C释放后，caspase-2、caspase-8和p53被激活。

    Takeuchi等[24]研究了18α-甘草次酸（18α- GA glycyrrhetinic）对硝苯地平诱导牙龈过度生长患者牙龈成纤维细胞生长、细胞周期和凋亡的影响。研究表明，18α-GA通过抑制G1向S期转变和诱导细胞凋亡，抑制硝苯地平诱导的牙龈过度生长患者的牙龈成纤维细胞的生长。caspase-3和caspase-9的活性增高，接着是胞浆细胞色素C蛋白的表达增加和bcl-xl和bcl-2蛋白的表达减少。总之，18α-GA通过抑制G1/S期转变和诱导细胞凋亡从而抑制牙龈成纤维细胞增多。

    通过这些研究，大家不难发现通过线粒体依赖性凋亡途径，牙龈成纤维细胞的程序性细胞死亡可能被抑制，该途径受Bcl-2家族蛋白（包括Bcl-2或Bcl-xl）、caspases、细胞色素C和p53的调控。CIGO的形成可能与牙龈成纤维细胞的程序性细胞死亡可能被抑制，导致牙龈成纤维细胞累积从而引起牙龈增生。

    3? CIGO中牙龈上皮细胞的分化和凋亡

    大家知道CIGO病理特点是角化上皮覆盖结缔组织基质，上皮嵴可深入结缔组织。主要表现为角质化鳞状上皮伴棘皮病变和延伸至结缔组织深处的形成管状钉突，棘细胞层明显增厚，管状伸长的上皮钉突深入结缔组织固有层[14]。

    Nimmi等[25]在1990年就研究发现药物诱导的牙龈过度生长组织在基础角质形成细胞中显示较少的DNA聚合酶，这表明上皮性棘皮病变可能是由于寿命延长而不是角质形成细胞增殖增加所致。Orrenius等[26]研究发现钙的持续升高能激活降解酶（如：钙依赖性蛋白酶和负责DNA降解的核酸内切酶），而在低钙条件下，牙龈角质形成细胞的凋亡受到抑制。随后有研究发现Bcl-2癌蛋白抑制上皮细胞的分化和凋亡，Bcl-2癌蛋白在基底细胞层上的过度表达，这与增生上皮角化层角化有关，Bcl-2过表达可能通过抑制晚期分化，延长增生牙龈上皮细胞的寿命，使牙龈上皮细胞凋亡受抑制，导致基底细胞层细胞堆积，导致牙龈增生[27]。

    钙通道阻滞剂的一个机制—抑制细胞内钙的摄取。钙长期以来被认为是凋亡途径的参与者，参与钙稳态的主要细胞器是内质网和线粒体。Bcl-2家族成员对内质网钙动力学及线粒体膜完整性和功能有影响，尤其是内质网钙的释放及其被线粒体的吸收，是触发细胞色素C释放和凋亡体形成的关键[28]。Shimuzu等[29]研究硝苯地平诱导大鼠牙龈增生中，发现硝苯地平诱导牙龈上皮增生不是通过增加角质形成细胞的增殖，而是通过减少上皮增生前的凋亡来延长细胞的寿命。Arunachalam LT等[30]比較了氨氯地平和健康对照组受试者牙龈样本中Bcl-2的表达，并进行了相关性分析。因Bcl-2通过影响细胞内钙的再分配抑制细胞凋亡。研究发现在低钙条件下，生长的牙龈上皮角质形成细胞表达Bcl-2，细胞的凋亡受到抑制;相反，高钙条件下生长的牙龈上皮角质形成细胞表达Bax，从而诱导细胞凋亡。而且，这项研究还将治疗持续时间与牙龈过度生长联系起来，可能牙龈组织长期暴露在药物作用下，促进了Bcl-2表达，从而抑制牙龈角质形成细胞凋亡。在这种情况下，推测Bcl-2通过内质网抑制钙的释放，从而调节内质网中钙的流量来控制到达线粒体“死亡信号”的幅度，从而阻止caspase的激活和抑制线粒体细胞色素C的释放。从这些研究中发现可能存在着这样一个机制：钙通道阻滞剂通过Bcl-2家族成员抑制细胞色素C释放，调控牙龈上皮细胞凋亡，从而导致牙龈增生。

    4? CIGO中牙龈间充质干细胞的细胞凋亡受microRNAs调控的影响

    microRNAs（miRNAs）是-类内生的、长度约20～24个核苷酸的非编码小RNA，其作用是干扰多个靶基因的转录后表达。近十年， miRNAs成为研究热点之一，已证实miRNAs在机体生长发育及多种疾病（如肿瘤等）中起调节作用外，也参与牙周疾病和健康中发挥重要作用[31]。Carleton等[32]研究表明，一些microRNAs直接或间接靶向编码与细胞增殖和细胞周期进展相关的蛋白质的转录物。最近，Jin等[33]发现了牙龈结缔组织来源的间充质干细胞，且牙龈组织的动态生理或病理生理过程似乎与牙龈间充质干细胞的功能变化有关。Li等[34]研究发现，牙龈间充质干细胞被诱导分化为促纤维化表型，这可能是炎症性牙龈增生的基础。因此，我们有理由相信牙龈间充质干细胞功能障碍与药物性牙龈增生密切相关。Han X等[35]研究发现NIF促进了牙龈间充质干细胞的增殖，mir-3940-5p的过表达抑制了NIF处理后牙龈间充质干细胞的增殖。细胞周期分析显示细胞周期阻滞在G0/G1期。Hannon[36]和Schwaller等[37]早期研究表明p15ink4b、p18ink4c和p19ink4d是G1细胞周期抑制剂，通过解除CDK4/6的抑制作用，导致G0/G1期细胞停滞。在Han X等[35]的研究中用NIF治疗牙龈间充质干细胞时、mir-3940-5p上调p15ink4b、p18ink4c、p19ink4d、p21cip1、Cyclin A、Cyclin D及下调Cyclin E，这说明mir-3940-5p可控制细胞增殖及细胞周期。这支持mir-3940-5p参与NIF诱导的牙龈过度生长，并可能作为NIF诱导的牙龈过度生长治疗的分子靶点。这些研究说明microRNAs可能在CIGO发生发展中起到重要作用，为以后的CIGO发生机制的研究提供了方向。

    5? 小结

    钙离子通道阻滞剂引起牙龈过度增生的致病机制复杂，现今研究已证实钙离子通道阻滞剂引起牙龈过度增生的发生、发展与牙龈组织细胞凋亡受到抑制密切相关，而Bcl-2基因和microRNAs在牙龈组织细胞凋亡起到重要作用。因此，研究Bcl-2基因、microRNAs与钙离子通道阻滞剂介导的牙龈过度增生相关的机制，能为钙离子通道阻滞剂介导牙龈过度增生的治疗提供新的方向。

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    [收稿日期]2019-11-20

    本文引用格式： 楊儒壮，张瑜，齐羲明.钙通道阻滞剂对牙龈组织细胞凋亡的影响及相关研究进展[J].中国美容医学，2020，29（12）：190-193.