运动对Fetuin—A诱导的胰岛素抵抗鼠骨骼肌IR和IRS1磷酸化的影响

2022.10.31

张明军

摘要：为了解运动对Fetuin-A诱导的胰岛素抵抗鼠骨骼肌IR和IRS1磷酸化的影响。运用牛fetuin-A 注射建立胰岛素抵抗鼠模型。将小鼠分为一次性运动组（Acute exercise group，AE）、8周运动组（Exercise group，E）、安静对照组（Control group，C）。结果：与C组比较，AE组和E组胰岛素抵抗指数均非常显著下降（P<0.01）；AE组骨骼肌IRS1（Tyr612）磷酸化非常显著增加（P<0.01）；E组骨骼肌IR（Tyr1150）磷酸化和IRS1（Tyr612）磷酸化均非常显著增加（P<0.01）；AE组和E组骨骼肌GLUT4mRNA表达和骨骼肌葡萄糖摄取率均非常显著增加（P<0.01）。结果说明：运动能够非常显著改善Fetuin-A诱导的胰岛素抵抗，8周有氧运动机制与增加骨骼肌IR（Tyr1150）、IRS1（Tyr612）磷酸化和GLUT4 mRNA表达有关。急性运动与增加骨骼肌IRS1（Tyr612）磷酸化和GLUT4 mRNA表达有关。

关键词：运动生物化学；Fetuin-A蛋白；胰岛素抵抗；IR（Tyr1150）磷酸化；IRS1（Tyr612）磷酸化；小鼠

中图分类号：G804.7 文献标志码：A 文章编号：1006-7116（2014）02-0141-04

Fetuin-A（又名a2-Heremans-Schmid糖蛋白，AHSG）是一种含量丰富的血清蛋白，主要由肝脏、胎盘合成，其作用广泛，涉及胰岛素抵抗的发生、血管钙化、骨代谢和蛋白酶活性调节等[1-3]。Fetuin-A能够抑制胰岛素信号传导，诱导胰岛素抵抗产生[4-7]。血浆Fetuin-A水平与损害的葡萄糖耐受、胰岛素抵抗、代谢综合征、脂肪肝、动脉粥样硬化和脂代谢紊乱密切相关[8-10]。运动减体重、药物以及饮食干预均能够通过降低成年人[11-13]、儿童[14]Fetuin-A水平，改善胰岛素抵抗。

鉴于Fetuin-A通过抑制细胞胰岛素受体的酪氨酸磷酸化，影响胰岛素信号传导，导致胰岛素抵抗，并与全身性胰岛素抵抗的发生关系密切，而运动和减体重能够降低血清Fetuin-A水平，改善胰岛素抵抗，推测其机制可能与运动调节Fetuin-A抑制的胰岛素信号传导过程有关，而胰岛素信号传导过程中的关键信号蛋白变化则可以解释本机制，因此，为了在分子水平揭示运动改善Fetuin-A诱导的胰岛素抵抗作用机制，本研究拟采用高生理剂量的Fetuin-A腹腔注射实验鼠，建立Fetuin-A诱导的胰岛素抵抗模型，研究胰岛素抵抗的发生、骨骼肌胰岛素信号传导蛋白中胰岛素受体（IR）、胰岛素受体底物1（IRS1）和葡萄糖转运的变化情况，以及运动干预后变化特征，尝试揭示运动改善Fetuin-A诱导的胰岛素抵抗机制。

1 材料与方法

1.1 材料

多克隆抗IR酪氨酸磷酸化抗体（tyrosine1150）、抗IRS1酪氨酸磷酸化抗体（IRS1 tyrosine612）以及胰岛素放射免疫试剂盒（Biosource）、牛Fetuin-A（纯度95%）购自厦门慧嘉生物公司。

1.2 方法

1）造模和动物分组及运动干预。

选用SPF级KM小鼠，8周龄，体重（44.52.3） g。胰岛素抵抗模型制备：实验鼠予纯度为95%的牛Fetuin-A腹腔注射，每公斤体重剂量为 0.75 mg[1]。8 h后检测血液和各项生化指标。以胰岛素抵抗指数（HOMA-IR）判定Fetuin-A诱导的胰岛素抵抗模型是否造模成功。胰岛素抵抗指数（HOMA-IR）=空腹胰岛素（IU·L-1）×空腹血糖（mmol·L-1）÷22.5。8 h后检测HOMA-IR，Fetuin-A腹腔注射导致胰岛素抵抗产生（Fetuin-A注射组（24.6±1.4）与对照组（11.1±1.6）比较，P<0.01）。对照组给予等量的生理盐水。

造模成功的小鼠随机分为安静对照组（Control group，C）、一次性运动组（Acute exercise group，AE）和8周运动组（Exercise group，E）3组，每组6只。AE组和E组在跑台上进行有氧运动干预，跑台速度15 m/min，60 min/d，5 d/周，运动强度约为70%～75%最大摄氧量[15]。AE组进行1次运动；E组运动持续8周，同时执行牛Fetuin-A腹腔注射，1次/d。

2）试验指标检测。

（1）禁食12 h，运动结束后10%水合氯醛腹腔注射麻醉，心脏取血，断头处死后取腓肠肌组织备用。空腹血糖以京都血糖仪检测。放射免疫法依照说明书检测空腹胰岛素。

（2）RT-PCR法检测GLUT4mRNA：提取总RNA，检测RNA纯度和完整性，依照试剂盒说明书进行逆转录。内参β-actin上游引物：5-AGATAG ACGT GCAC AGGAAG-3，下游引物：5-GCTGGCGAACCGCCAG AGCT-3；GLUT4上游引物5-CGTGCGTGACATTAA AGAG-3，下游引物5-CTGGAAGGTGGACAGTGAG-3。PCR产物琼脂糖凝胶电泳成像，凝胶成像分析系统分析，待测基因的相对表达量：待测基因用β-actin表示。

（3）胰岛素（10 nmol/L）刺激腓肠肌经20 min后，液闪计数仪测定腓肠肌细胞葡萄糖摄取率（pmol/（mg·min））[17]。

（4）免疫共沉淀检测蛋白磷酸化。各组细胞予胰岛素刺激后，细胞裂解取上清。100 μg细胞溶解物SDS-PAGE蛋白分离、转膜，予抗IR和IRS1抗体，加100 μL质量分数10% A-Sepharose沉淀，免疫沉淀复合物洗涤，上样缓冲液煮沸、离心，取上清，电泳、转膜、封闭过夜，分别加IR和IRS1抗磷酸酪氨酸抗体，洗膜，加辣根过氧化物酶标记的Ⅱ抗；曝光，洗涤后与ECL反应，光密度定量分析采用LeicaQ图像分析仪（德国）。

3）统计学处理。

各组实验数据均采用均数±标准差表示，统计采用SPSS16.0统计软件。各组的各变量进行单因素方差分析，LSD检验。显著性水平和非常显著性水平分别取P<0.05和P<0.01。

2 结果及分析

2.1 胰岛素抵抗性和骨骼肌GLUT4mRNA表达

胰岛素抵抗指数AE组（19.1±0.8）和E组（17.8±1.5）比C组（24.8±2.4）降低，差异具有非常显著性意义（P<0.01）。骨骼肌GLUT4mRNA表达AE组（0.73±0.20）和E组（0.70±0.20）比C组（0.37±0.10）增加，差异具有非常显著性意义（P<0.01）。

2.2 骨骼肌IR、IRS1磷酸化和葡萄糖摄取率

与C组相比，AE组IR（Tyr1150）磷酸化增加，差异没有显著性意义（P>0.05）；E组IR（Tyr1150）磷酸化增加，差异具有非常显著意义（P<0.01）；AE组和E组IRS1（Tyr612）磷酸化增加，差异都具有非常显著性意义（P<0.01）（见图1）。

骨骼肌葡萄糖摄取率AE组（58.9±4.1）和E组（61.7±2.2）比C组（20.1±1.2）增加，差异具有非常显著性意义（P<0.01）。

3 讨论

为了研究运动影响Fetuin-A诱导的胰岛素抵抗机制，必须制备Fetuin-A诱导的胰岛素抵抗模型，从而排除其它致胰岛素抵抗的因素干扰。参考Hennige A M[1]的研究，本研究采取牛Fetuin-A（纯度95%，0.75 mg/g体重）腹腔注射的方法建立Fetuin-A诱导的胰岛素抵抗模型，检测模型鼠胰岛素抵抗指数，比正常对照组显著增加，Fetuin-A诱导的胰岛素抵抗模型造模成功。

Fetuin-A在1944年被发现是血液中一种含量较丰富的糖蛋白，作用广泛，主要由肝脏细胞合成并分泌到血液中[17]。最近有关Fetuin-A与肥胖、糖尿病、胰岛素抵抗关系的研究成为了热点。对3 710例调查对象的检测显示：独立于性别、种族或心血管疾病因子，高血清Fetuin-A与老年人2型糖尿病的发病率密切相关，而且年龄超过75周岁，这种相关性的程度将更加显著[18]。欧洲人癌症和营养展望调查显示，独立于现有的其它相关风险因素，循环Fetuin-A将预示未来7年的2型糖尿病发病几率[19]。针对健康、老年和体成分的研究也显示：独立于其它胰岛素抵抗的风险因素，血清Fetuin-A 水平与随后6年的Ⅱ型糖尿病发病几率密切相关[8]。针对运动、饮食干预和手术减重的研究也发现了Fetuin-A变化与胰岛素抵抗之间的关系。322名实验者经过2年的饮食干预减重后，随着体重减轻，血清Fetuin-A水平降低，胰岛素抵抗、血脂和其它代谢指标也出现了良性改变[20]。而胃绕道手术后体重的减轻可以降低肥胖者血清Fetuin-A、胰岛素抵抗，预计将使这些对象未来10年罹患糖尿病的几率降低约70%[11，21]。针对胰岛素信号蛋白的研究也部分揭示了Fetuin-A诱导胰岛素抵抗机制，Fetuin-A与IR酪氨酸磷酸酶结合，抑制胰岛素信号向下游的传导，导致胰岛素抵抗的产生[17]。重组Fetuin-A孵育的纤维母细胞中胰岛素刺激的IR自磷酸化被抑制了80%，胰岛素刺激的IR亚单位的酪氨酸磷酸化被抑制了40%，出现胰岛素抵抗。

本研究中模型鼠在接受了Fetuin-A腹腔注射后，出现严重的胰岛素抵抗，随即分别给予一次急性运动和8周有氧运动干预，结果显示：急性运动组和8周有氧运动组鼠的胰岛素抵抗指数分别比安静对照组非常显著降低（P0.05），IRS1（Tyr612）磷酸化则非常显著增加（P<0.01）（见图1）。而8周有氧运动组则呈现了与急性运动组不同的变化特征，与安静对照组比较，运动组骨骼肌IR（Tyr1150）和IRS1（Tyr612）磷酸化均非常显著增加（P<0.01）（见图1）。作为胰岛素信号传导的效应，骨骼肌细胞内功能蛋白GLUT4承担着葡萄糖转运的功能，协助将葡萄糖摄取入细胞内，实现葡萄糖的跨膜转运。本研究中，与安静对照组比，急性运动组和8周有氧运动组RT-PCR法检测的骨骼肌GLUT4mRNA表达和液闪仪测定的骨骼肌葡萄糖摄取率均呈现了相似的非常显著增加趋势（P<0.01）。

综上所述，Fetuin-A对骨骼肌胰岛素信号蛋白IR和IRS1均产生了抑制作用，诱导了胰岛素抵抗的产生，研究结果与以往的研究结果一致。运动则能够改善Fetuin-A胰岛素抵抗，机制与运动解除了Fetuin-A 对IR和IRS1的抑制有关，但是急性运动和8周有氧运动的具体作用位点呈现差异，即急性运动仅仅能够解除IRS1（Tyr612）磷酸化的抑制，而8周有氧运动则能够解除IR（Tyr1150）和IRS1（Tyr612）磷酸化的双重抑制。运动恢复了Fetuin-A影响的胰岛素信号传导功能，最终增加了骨骼肌GLUT4mRNA的表达，使得骨骼肌葡萄糖转运和摄取功能增强，改善了胰岛素抵抗。

本研究的不足之处在于仅仅分析了骨骼肌胰岛素信号蛋白中IR和IRS1磷酸化变化情况，而Fetuin-A对胰岛素抵抗的影响必然涉及大量信号蛋白和相关调节酶，因此本研究也必然存在较大的局限性，有待于在后续的研究中不断补充和完善。

参考文献：

[1] Hennige A M，Staiger H，Wicke C，et al. Fetuin-A induces cytokine expression and suppresses adiponectin production[J]. PLoS One，2008，3（3）：e1765.

[2] Mori K，Emoto M，Inaba M. Fetuin-A：a multifunctional protein[J]. Recent Pat Endocr Metab Immune Drug Discov，2011，5（2）：124-146.

[3] Ou H Y，Wu H T，Hung H C，et al. Endoplasmic reticulum stress induces the expression of fetuin-A to develop insulin resistance[J]. Endocrinology，2012，153（7）：2974-2984.

[4] Mathews S T，Srinivas P R，Leon M A，et al. Bovine fetuin is an inhibitor of insulin receptor tyrosine kinase[J]. Life Sci，1997，61（16）：1583-1592.

[5] Yang S J，Homg H C，Choi H Y，et al. Effects of a three-month combined exercise programme on fibroblast growth factor 21 and fetuin-A levels and arterial stiffness in obese women[J]. Clinical Endocrinology，2011，75（4）：464-69.

[6] Srinivas P R，Wagner A S，Reddy L V，et al. Serum alpha 2-HS-glycoprotein is an inhibitor of the human insulin receptor at the tyrosine kinase level[J]. Mol Endocrinol，1993，7（11）：1445-1455.

[7] Ix J H，Sharma K. Mechanisms linking obesity，chronic kidney disease，and fatty liver disease：the roles of fetuin-A，adiponectin，and AMPK[J]. J Am Soc Nephrol，2010，21（3）：406-412.

[8] Ix J H，Wassel C L，Kanaya A M，et al. Fetuin-A and incident diabetes mellitus in older persons[J]. JAMA，2008：300（2）：182-188.

[9] Mori K，Emoto M，Yokoyama H，et al. Association of serum fetuin-A with insulin resistance in type 2 diabetic and nondiabetic subjects[J]. Diabetes Care，2006，29（2）：468-471.

[10] Ix J H，Shlipak M G，Brandenburg V M，et al. Association between human fetuin-A and the metabolic syndrome：data from the Heart and Soul Study[J]. Circulation，2006，113（14）：1760-1767.

[11] Brix J M，Stingl H，Hollerl F，et al. Elevated Fetuin-A concentrations in morbid obesity decrease after dramatic weight loss[J]. J Clin Endocrinol Metab，2010，95（11）：4877-4881.

[12] Jenkins N T，McKenzie J A，Hagberg J M，et al. Plasma fetuin-A concentrations in young and older high- and low-active men[J]. Metabolism，2011，60（2）：265-271.

[13] Reinehr T，Roth C L. Fetuin-A and its relation to metabolic syndrome and fatty liver disease in obese children before and after weight loss[J]. J Clin Endocrinol Metab，2008，93（11）：4479-4485.

[14] Chan D C，Watts G F，Gan S K，et al. Effect of ezetimibe on hepatic fat，inflammatory markers，and apolipoprotein B-100 kinetics in insulin-resistant obese subjects on a weight loss diet[J]. Diabetes Care，2010，33（5）：1134-1139.

[15] Thomas D P，Zimmerman S D，Hansen T R，et al. Collagen gene expression in rat left ventricle： interactive effect of age and exercise training[J]. J Appl Physiol，2000，89（4）：1462-1468.

[16] Fang R P，Zhou X. Hyperglycemia- and hyperinsulinemia-induced alteration of adiponectin receptor expression and adiponectin effects in L6 myoblasts[J]. J Mol Endocrinol，2005，35：465-476.

[17] Ix J H，Chertow G M，Shlipak M G，et al. Fetuin-A and kidney function in persons with coronary artery disease--data from the Heart and Soul Study[J]. Nephrol Dial Transplant，2006，21（8）：2144-2151.

[18] Ix J H，Biggs M L，Mukamal K J，et al. Association of fetuin-a with incident diabetes mellitus in community-living older adults：the cardiovascular health study[J]. Circulation，2012，125（19）：2316-2322.

[19] Stefan N，Fritsche A，Weikert C，et al. Plasma fetuin-A levels and the risk of type 2 diabetes[J]. Diabetes，2008，57（10）：2762-2767.

[20] Bluher M，Rudich A，Kloting N，et al. Two patterns of adipokine and other biomarker dynamics in a long-term weight loss intervention[J]. Diabetes Care，2012，35（2）：342-349.

[21] Sjostrom L，Narbro K，Sjostrom C D，et al. Effects of bariatric surgery on mortality in Swedish obese subjects[J]. N Engl J Med，2007，357（8）：741-752.