基于核酸外切酶Ⅲ及DNAzyme的铅离子荧光传感器的研究

    刘涛 李丹 梁杰 汪秀妹

    

    

    

    摘?要?利用DNAzyme及核酸外切酶Ⅲ（Exo Ⅲ）构建了荧光生物传感器用于检测铅离子（Pb2+）。DNAzyme与底物探针结合并在Pb2+辅助作用下切割底物，使发夹结构的底物探针在环上修饰有RNA碱基处断裂，切割断裂底物探针后，DNAzyme被释放，继续与下一个底物探针结合并切割，利用DNAzyme可循环反复催化裂解底物的特性实现循环反应。底物探针被切割断裂后，形成的Y字形探针可与信标探针结合并打开其发夹结构，产生荧光信号，同时在Exo Ⅲ的作用下降解， 从3′端开始切割水解被打开的信标探针， 释放出底物探针， 继续与下一个信标探针结合切割，形成第二步的循环信号放大。经过两步的循环反应， 荧光信号得到不断增强，从而达到高灵敏检测的目的。 200 μL反应体系在37℃反应60 min后，其荧光信号与Pb2+浓度在0.05～200 nmol/L范围内呈良好的线性关系，检出限为0.01 nmol/L。用于实际样品中Pb2+的检测，加标回收率为96.3%～108.3%。本方法具有简单、快速、高选择性、高灵敏的特点，在Pb2+检测方面有良好的应用潜力。

    关键词?铅离子; 脱氧核酸酶; 核酸外切酶 Ⅲ; 荧光生物传感器

    1?引 言

    铅离子（Pb2+）作为一种常见重金属污染物，可通过皮肤、消化系统和呼吸系统进入血液，并且可在人体器官和组织中积累，导致神经、生殖、心血管系统疾病和发育障碍，特别是对于儿童发育健康影响最大[1～3]?。近年来，随着我国新能源汽车产业的迅速发展及电动助力车、电动自行车行业的大量需求，铅蓄电池产量迅速增长[4]。铅蓄电池产量迅速增加的同时，在铅蓄电池的生产、使用及废电池回收等环节都有可能产生污染。 因此， 建立简单、快速、高灵敏的Pb2+检测方法，对环境及生物样品的分析检测有重要的意义。

    Pb2+的常规分析方法主要包括电感耦合等离子质谱法[5，6]、原子吸收光谱法[7]和原子发射光谱法[8]、原子荧光光谱法[9，10]、及电化学法[11]等;这些方法可实现对铅的特异性、高灵敏检测，但多需要昂贵精密的仪器，且操作步骤复杂，需专业人员进行操作，检测成本较高。近年来，生物传感器的快速发展为金属离子检测提供了简单、快速、低成本的方法。DNA分子的磷酸根阴离子骨架易与金属阳离子结合，且具有高稳定性、易合成、易修饰、可在体外进行序列筛选等优点，被广泛用于构建金属离子生物传感器[12]。Pb2+传感器的设计中常使用G-四链体[13，14]及DNAzyme两种DNA分子。G-四链体是由富含鸟嘌呤碱基的单链DNA片段在特定金属离子的作用下折叠形成的特殊的DNA二级结构[15]。Pb2+可与G-四链体特异性结合，并维持其结构的稳定[16]，基于该性质发展了多种Pb2+传感器[17，18]。除Pb2+外，K+、Na+、 Sr2+及Ba2+等[12]金属离子也可与G-四链体结合，并发挥与Pb2+相似的功能，因此可能对Pb2+检测产生干扰。

    DNAzymes是对特定底物具有高催化活性的功能核酸，在特定金属离子的辅助作用下可催化底物链断裂[19]，基于此，建立了各种类型的Pb2+传感器。Zhang等[20]将8-17DNAzyme及其底物结合形成一条单链并组装在金电极表面，设计了一种简单、高灵敏的电化学检测Pb2+的方法;李宸葳等[21]利用GR-5 DNAzyme结合G-四链体，设计了一种高灵敏的比色传感器用于检测Pb2+。尽管基于DNAzyme的催化切割反应，建立了多种电化学及比色传感器实现了对Pb2+的灵敏检测，但电化学方法多需对电极进行抛光处理及固定DNA探针的操作，而比色法的反应步骤较为繁琐，多需额外的显色步骤，对操作的要求较高，不便于简单快速检测。荧光法单操作简， Zhang等[22]利用DNAzyme结合分子信标及催化放大策略开发了一系列高灵敏、低背景的金属离子荧光检测方法。核酸工具酶如核酸外切酶、限制性内切酶及聚合酶等被广泛应用于DNA传感器的构建[24～28]，常被用于信号放大，如赵永席等[23]利用DNA限制性内切酶建立了一种荧光循环放大策略， 实现Pb2+高灵敏检测。

    本研究利用DNAzyme可循环反复催化裂解底物的特性[22]及核酸外切酶Ⅲ辅助循环放大两种信号放大策略，构建了一种简单、快速、高灵敏、高特异性的荧光DNA生物传感器，用于检测Pb2+。

    2?实验部分

    2.1?仪器与试剂

    CaryEclipse分子荧光光谱仪（美国瓦里安公司）;DK-S22恒温水浴锅（上海精宏公司）;Ultrapure实验室纯水系统（上海和泰公司）。

    所有DNA序列均由上海生工生物有限公司合成，序列见表1;铅标准溶液及其它金属离子标准溶液均购自国家有色金属及电子材料分析测试中心;核酸外切酶Ⅲ（ExoⅢ）購自NEB公司，其它试剂均为分析纯，购自阿拉丁试剂公司。

    2.2?实验方法

    2.2.1?DNA发夹探针预处理?底物探针及信标探针用10 mmol/L TE缓冲液（10 mmol/L Tris-HCl; 1 mmol/L EDTA，100 mmol/L NaCl，10 mmol/L MgCl2，pH= 7.4）溶解，配制成浓度为1 μmol/L的储存液。将两种探针溶液在90℃孵育10 min，自然冷却至室温，以确保探针形成发夹结构。

    2.2.2?Pb2+的检测?取40 μL信标探针、20 μL底物探针及10 μL 8-17DNAzyme于0.5 mL离心管，依次加入20 μL NE缓冲液1（10 mmol/L Bis-Tris-丙烷-HCl，10 mmol/L MgCl2，1 mmol/L DTT， pH=7.0）、16 U Exo Ⅲ、20 μL不同浓度的Pb2+溶液、90 μL缓冲液，于37℃孵育60 min。反应结束后，测定荧光光谱， 激发波长494 nm，扫描范围500～600 nm。

    3?结果与讨论

    3.1?实验原理

    构建的检测Pb2的荧光传感器原理如图1所示。反应过程分为两步，首先，DNAzyme与底物探针结合，在Pb2+辅助作用下切割底物，使发夹结构的底物探针在环上修饰有RNA碱基处断裂，发夹结构破坏后，受到碱基配位个数的影响，在反应温度下，DNAzyme与断裂后的底物不能稳定结合，进而被释放，继续与下一个底物探针结合，并再次切割，如此循环反复进行，利用DNAzyme可循环反复催化裂解底物的特性实现第一步的循环放大。底物探针被切割断裂后，形成的Y字形探针可与信标探针杂交结合，并打开其发夹结构，使荧光基团与淬灭基团分离， 从而发出荧光信号，同时在Exo Ⅲ的作用下降解， 从3′端开始切割被打开的信标探针，释放出底物探针，继续与下一个信标探针结合切割，形成第二步的循环信号放大。经过两步的循环反应， 单个Pb2+产生的信号被持续放大，从而达到高灵敏检测的目的。Pb2+不存在时， DNAzyme虽可与底物探针结合，但不能被断裂，不能引发第一步反应;同时，由于空间位阻及碱基杂交个数的影响，游离的底物探针无法与信标探针结合，不能产生荧光信号。

    3.2?方案可行性验证

    对构建的外切酶Ⅲ辅助基于DNAzyme的信号放大策略Pb2+检测传感器的可行性进行了验证。如图2所示，不存在Pb2+的空白对照组的荧光信号很低;当Pb2+存在时，与空白背景组相比，荧光信号显著增强，且对不同浓度Pb2+的荧光响应值也不同。以上结果表明，构建的Pb2+传感体系设计方案可行。

    3.3?实验条件优化

    3.3.1?信标探针碱基杂交个数的优化?发夹结构的信标探针中碱基的杂交个数对于整个反应体系荧光信号的产生有重要影响，因此首先对信标探针序列进行了优化，结果见图3。信标探针中碱基杂交个数过多，会造成底物形成的Y型探针与之结合困难，荧光信号降低;信标探针碱基杂交个数较少，会造成整个体系的背景信号偏高。由图3可见，当信标探针中碱基杂交个数为12时结果最优。

    3.3.2?反应时间的优化?反应时间对荧光信号有重要的影响，反应时间不足，会造成荧光信号强度低; 反应时间过长，可能会造成背景信号上升。对反应时间进行了优化，每间隔10 min测定样品组及对照组的荧光信号强度。如图4A所示，60 min前，荧光信号随着时间延长而增强;60 min后，随时间延长，荧光信号虽有所增加，但是背景信号也开始增强。因此，选择60 min为检测体系的反应时间。

    3.3.3?反应温度的选择?反应温度主要对Exo Ⅲ活性以及DNA探针的结合有影响，在25℃～40℃范围内对反应温度进行了优化，如图4B所示，在25℃～37℃范围内，荧光信号强度随温度升高而增加，这是由于随着反应温度升高，外切酶的活性增加;反应温度高于37℃时，随温度升高，荧光信号显著下降，原因是高使酶的活性降低，同时也会造成DNAzyme与底物探针的结合能力减弱，使其对底物的切割效率降低。因此，为获得最佳的实验效果，反应温度选择37℃。

    3.4?传感器的特异性分析

    分别采用Ca2+、Mg2+、Cd2+、Cu2+、Mn2+、Ni2+、Zn2+ 及Cr3+等金属离子考察了传感器对Pb2+的选择性， Pb2+浓度为200 nmol/L，其它金属离子浓度为10 μmol/L，结果如图5A所示。与Pb2+产生的荧光信号相比，其它金属离子产生的荧光信号可以忽略不计，表明所构建的传感器对Pb2+具有良好的选择性。同时，为进一步验证其特异性，测定了Pb2+（浓度200 nmol/L）与其它金属离子（Ca2+、Mg2+、Cd2+、Mn2+，浓度均为10 μmol/L）共存时传感器的响应，如图5B所示，其它金属离子的存在对Pb2+的检测无明显影响，进一步表明构建的传感器有良好的选择性。

    3.5?Pb2+的定量分析

    在最优的实验条件下，测定了不同Pb2+浓度时体系的荧光信号。如图6所示，Pb2+浓度在0.05～200 nmol/L范围内，其荧光信号强度和Pb2+浓度呈线性相关，线性相关系数R2=0.998，检出限为0.01 nmol/L（S/N=3），远低于我国生活饮用水卫生标准（GB5749-2006）中Pb2+限值0.01 mg/L（～50 nmol/L），也低于文献报道的Pb2+传感器[20～23]（表2）。

    3.6?实际水样分析

    为了进一步验证构建的Pb2+传感器在实际样品中的应用性能，分別采集自来水与校园内湖水，经过0.22 μm滤膜过滤后， 测定Pb2+含量，结果见表3。所采集的样品未检出Pb2+，加标回收率为96.3%～108.3%之间。

    4?结 论

    利用金属DNAzyme可循环切割底物的特性及核酸外切酶 Ⅲ不需特定识别序列对双链DNA水解的性质，设计构建了两步循环信号放大的Pb2+生物传感器， 实现了对Pb2+的高灵敏检测。此传感器具有简单、快速、特异性高、灵敏度高等特点，在实际样品检测中具有良好的应用前景。

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    A Fluorescence Biosensor for Lead Ion Detection

    Based on DNAzyme and Exonuclease Ⅲ

    LIU Tao*， LI Dan， LIANG Jie， WANG Xiu-Mei

    （Fujian Provincial Key Laboratory of Ecology-Toxicological Effects & Control for Emerging Contaminants College of

    Environmental and Biological Engineering， Putian University， Putian 351100， China）

    Abstract?A fluorescence sensor for Pb2+ detection was developed on the basis of a DNAzyme cleavage and exonuclease Ⅲ assistant amplification strategy. In the presence of Pb2+， the DNAzyme hybridized with substrate strand and catalyzed the hydrolytic cleavage of the substrate strand， and then the DNAzyme released from the substrate strand and bound another substrate strand to trigger another cycle of hydrolytic cleavage. The DNAzymes were used as catalysts for amplified sensing through multiple turnover reactions. The substrate probe was cleavaged and broken to form a Y-shaped probe which could hybridize and open the molecular beacon， resulting in the increase of the fluorescence signal. At the same time， exonuclease Ⅲ catalytically digested the molecular beacon from 3′-end and released the Y-shaped substrate strand. The released Y-shaped substrate strand could directly hybridize with another molecular beacon to generate fluorescence signal， and thus was further recognized and cleaved by exonuclease Ⅲ from the second step of cyclic signal amplification. Accompanying with each cleavage toward molecular probe by exonuclease Ⅲ， the fluorescence signal was accumulated， which resulted in a cyclic amplification format for the fluorescence response toward Pb2+ detection. The fluorescence response was detected in a 200 μL reaction system that was incubated at 37℃ for 60 min. The linear range for detection of Pb2+ was 0.05-200 nmol/L with a detection limit of 0.01 nmol/L， and the recoveries of environmental water samples were 96.3%-108.3%. This method had many advantages such as simple operation， rapid detection， high selectivity and high sensitivity， and showed great application potential in Pb2+ detection.

    Keywords?Lead ion ; DNAzyme; Exonuclease Ⅲ; Fluorescence biosensor

    （Received 11 August 2019; accepted 10 December 2019）

    This work was supported by the National Natural Science Foundation of China （No. 31801462）， the Scientific Research Foundation of Fujian Provincial Education Department （No. JT180466） and the Scientific Research Foundation of Putian University （No. 2017015）.