基于氧气梯度共培养芯片的肿瘤细胞抗药性研究

    孙威 陈雨晴 汪明芳 王月荣 张敏 章弘扬 胡坪

    

    

    

    摘?要?肿瘤微环境是一个复杂的体系，对肿瘤的发展、侵袭和转移起至关重要的作用。本研究利用一个简单的氧气梯度芯片构建了体外肿瘤缺氧微环境模型。此芯片由产生氧气梯度的蛇形通道和用于小鼠肝癌细胞（Hepa1-6细胞）与肝星状细胞（JS-1细胞）共培养的3个平行通道组成，通过在肿瘤细胞生长的区域制造氧气梯度模拟肿瘤缺氧微环境。利用此芯片，开展了Hepa1-6细胞对紫杉醇和替拉扎明（TPZ） 的抗药性研究，并从分子机制上分析导致抗药性的可能原因。结果表明，芯片所产生的氧气梯度的浓度范围为2.3%～16.7%。在缺氧条件下，共培养的Hepa1-6细胞在TPZ作用下存活率显著下降，但对紫杉醇产生抗药性。免疫荧光分析结果表明，缺氧及共培养可提高细胞因子TIMP-1与TGF-β的表达，促使JS-1细胞活化，进而增强Hepa1-6细胞对紫杉醇的抗药性。

    关键词?微流控芯片; 肿瘤微环境; 氧气梯度; 细胞共培养; 抗药性

    1?引 言

    氧气梯度广泛存在于人体内的组织、器官中，不仅影响人体的内稳态平衡，还调控着体内细胞的多种行为[1，2]。人的组织与器官中的氧含量常低于大气中的氧含量，如人肝脏中的氧含量约为4%～6%[3]; 而在快速增殖的肿瘤中，远离血管的肿瘤细胞内的氧含量，甚至只有1%[4]。缺氧会影响细胞的各种行为，如加速细胞迁移[5]、促进干细胞分化[6]、促进血管生成[7]、促进肿瘤细胞生长[8]以及使肿瘤细胞产生抗药性[9，10]等。

    微流控技术具有高通量、集成化、样品消耗低、设计灵活、生物兼容性好等特点，已成为体外细胞生物学研究的强有力工具[11～16]。近年来，利用微流控技术成功建立了多种体外的缺氧模型[17～19]。由于微流控芯片的高度集成性，常用的体外氧气控制方法仍可在微芯片中使用，如利用厌氧培养箱调节氧气浓度[20，21]，或使用化学试剂CoCl2[22]或Na2SO3[23]吸收细胞培养基中的氧气，从而制造细胞缺氧。但这些方法通常只能制造单一的氧气浓度，不能形成氧气梯度，且化学试剂的加入难免对细胞造成损伤。广泛用于芯片制作的聚二甲基硅氧烷（Polydimethylsiloxane， PDMS）具有良好的透气性，因此可通过控制气体的扩散来制造缺氧。Adler等[24]构建了一个双层芯片，其中一层通道与氮气和氧气钢瓶相连，通过电脑控制气体混合的比例，利用两层芯片间PDMS膜的透气性，在另一层流体通道中形成氧气梯度。此氧气梯度稳定可控，被广泛用于细胞迁移[25]、血管生成[26]、胚胎发育[27]、药物实验[28]等研究中。但此方法需要使用气体钢瓶与气体混合器等大体积外部设备，实验操作复杂。为了避免使用气体钢瓶[29～31]，Chen等[32]构建了氧气梯度芯片，利用邻苯三酚与氢氧化钠混合可吸收周围氧气的性质，在芯片中制造了稳定的氧气梯度，并在缺氧条件下考察了抗肿瘤药物替拉扎明（TPZ）对A549肿瘤细胞的抗药性，结果表明，在缺氧条件下TPZ对A549细胞具有更大的杀伤性。

    目前，微流控芯片中氧气梯度构建方法及应用研究多关注单种细胞，而忽略了多种细胞之间的相互作用，这与真实的体内微环境不符。本研究组构建了一个氧气浓度芯片[33]，并证明缺氧环境中的肿瘤细胞与成纤维细胞共培养时，其迁移速率显著高于常氧与单培养条件; 此实验结果表明，缺氧作为肿瘤微环境的重要标志，对肿瘤细胞的各种行为具有调控作用。利用上述缺氧芯片，本研究在芯片中共培养小鼠肝癌细胞与小鼠肝星状细胞，从而更精准地模拟肝肿瘤微环境，考察了抗肿瘤药物在缺氧与共培养条件下的细胞毒性，并研究了肿瘤细胞产生抗药性的相关机制。

    2?实验部分

    2.1?仪器与试剂

    Ti-S倒置熒光显微镜、A1R激光共聚焦显微镜（日本尼康公司）; LSP04-1A微量注射泵（保定兰格恒流泵有限公司）; Multiskan FC酶标仪（美国Thermo Fisher公司）。

    聚二甲基硅氧烷（PDMS）前体及引发剂（美国Dow Corning公司）; PBS、DMEM培养基、0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液、胎牛血清、细胞核染料DAPI（4，6-diamidino-2-phenylindole）、CellTracker CMFDA与CMTPX（美国Thermo Fisher公司）; 噻唑蓝、邻苯三酚、紫杉醇、替拉扎明（TPZ）、戊二醛、Triton X-100、牛血清白蛋白（BSA）、三（4，7-联苯-1，10-邻菲啰啉）二氯化钌（II）、NaOH （美国Sigma公司）; Calcein-AM/PI活细胞/死细胞双染试剂盒（上海翊圣生物科技有限公司）; 抗α-SMA单克隆抗体、抗TIMP-1单克隆抗体、抗TGF-β单克隆抗体（美国Santa Cruz公司）; Alexa Fluor555荧光标记二抗（英国Abcam公司）。

    2.2?微流控芯片设计与氧气浓度的构建

    氧气梯度芯片包含缺氧通道和细胞培养单元两个部分（图1A）。缺氧通道宽200 μm，通道设计为蛇形，使得缺氧试剂充分混合; 细胞培养单元由3个平行的通道构成，每个通道之间以六边形的微柱阵列分隔，微柱直径75 μm，间距100 μm，细胞通道宽800 μm。

    根据文献[34]报道，邻苯三酚在碱性条件下能快速吸收周围的氧气。为了在芯片中获得稳定的氧气梯度，用微流泵将1 mol/LNaOH与5 mg/mL 邻苯三酚以5 μL/min的流速持续地引入缺氧通道，使相邻的细胞培养通道中形成长时间稳定的氧气梯度。

    为表征细胞培养通道中产生的氧气梯度，将200 μmol/L 荧光染料三（4，7-联苯-1，10-邻菲啰啉）二氯化钌（II）指示剂注入与缺氧通道相邻的细胞培养通道。当氧气存在时，指示剂发生荧光淬灭，根据Stern-Volmer方程：

    I0/I=1 + Kq[O2]（1）

    其中，I为待测体系的荧光强度，I0为氧气浓度为0时的荧光强度，Kq为淬灭系数。为了确定Kq，在缺氧通道中分别通入纯氮（氧气浓度为0%）与纯氧（氧气浓度为100%），则有：

    Kq=I0/I100-1（2）

    其中，I0为通入纯氮时的荧光强度，I100为通入纯氧时的荧光强度。通道中的氧气浓度可通过公式（3）计算：

    [O2]=（I0/I-1）/Kq（3）

    2.3?细胞培养及MTT实验

    小鼠肝癌细胞Hepa1-6与小鼠肝星状细胞JS-1用10% DMEM培养基培养，待细胞达到80%融合度时，用0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液将其消化，加入新鲜的DMEM培养基终止消化，1000 r/min离心5 min，弃去上清液，重悬细胞至所需浓度。

    将细胞重悬至5×103 个/μL的密度，接种至96孔板中，每孔加200 μL 细胞悬液，在37℃细胞培养箱中培养24 h，再分别加入200 μL不同浓度的紫杉醇或TPZ孵育24 h，最后使用MTT法检测各孔细胞活性，用于评价药物毒性。

    2.4?芯片中的细胞共培养

    芯片在使用前，首先置于紫外灯下照射1 h，再使用0.1 mg/mL 纤连蛋白包被芯片通道1 h，以促进细胞贴壁。将重悬后的Hepa1-6细胞（2×106 cell/mL）和JS-1细胞（1.5×106 cell/mL）用移液枪分别注入芯片中，将芯片置于培养箱中6 h，使细胞贴壁，然后将储液池中多余的细胞除去，并更换新鲜的培养基。芯片每12 h换液一次。

    使用活细胞染色实验对细胞的生长与增殖情况进行考察，分别使用CellTracker CMFDA与CMTPX对重悬的细胞染色30 min，再按上述方法将细胞注入芯片，待细胞完全贴壁2天后，使用倒置荧光显微镜拍摄其荧光图，观察细胞的生长与增殖情况。

    2.5?缺氧条件下的药物测试和细胞活力评估

    共设置了5组实验，分别为对照组、两种细胞的单培养组、共培养组以及缺氧共培养组。在接种细胞至芯片1天后，对照组更换正常的DMEM培养基，其余4组将培养基更换为适当浓度的药物，置于培养箱中培养24 h。使用Calcein-AM/PI活细胞/死细胞双染试剂盒对药物作用后的肿瘤细胞的存活率进行考察，活细胞显绿色荧光，死细胞显红色荧光。细胞存活率（p）由公式（4）计算：

    p=NG/（NG+NR） × 100%（4）

    其中，NG和NR分别是绿色荧光和红色荧光细胞的数量。

    2.6?细胞免疫荧光测定

    利用免疫荧光法对两种细胞进行免疫荧光染色。在药物作用24 h后，移去培养基，用PBS将芯片中的细胞培养通道冲洗3遍，加入2.5% 戊二醛固定30 min，清洗后，加入0.2% Triton X-100透化15 min， 用10% BSA封闭1 h，再分别加入α-SMA、TIMP-1、TGF-β一抗过夜，以Alexa Fluor555标记的IgG为二抗，于荧光显微镜下判定结果。

    3?结果与讨论

    3.1?微流控芯片结构与氧气梯度的表征

    本研究采用的氧气梯度芯片结构如图1A所示，左侧的缺氧区域用于产生化学缺氧，右侧的3个通道用于细胞的共培养。由于制作芯片采用的PDMS材料具有良好的透气性，细胞培养通道中的氧气透过PDMS被邻近缺氧通道中的邻苯三酚消耗。芯片右侧的细胞培养单元由3个平行的通道构成，每个通道之间用六边形微柱阵列分隔，由于存在微柱阻力与液体表面张力，流经的液体不会泄露至相邻通道中。因此，可在芯片的每個通道内接种不同种类的细胞，从而模拟细胞旁分泌作用。

    氧气梯度的荧光表征结果如图1B所示，此方法可在细胞培养区域制造宽度800 μm的缺氧环境，与肿瘤细胞培养通道的宽度接近。根据不同位置的荧光强度计算得到的氧气浓度（图1C），氧气浓度梯度的范围为2.3%～16.7%，与肿瘤内部的缺氧模式相近。此方法的优点是芯片结构简单，可产生稳定的氧气梯度，且试剂消耗量极少，相比于物理缺氧，不需要气体钢瓶等外部设备。

    3.2?芯片中小鼠肝癌细胞与肝星状细胞的共培养

    肿瘤微环境中存在大量的基质细胞，而星状细胞则是肝癌微环境中重要的基质细胞。为了在体外建立可靠的肿瘤模型，将Hepa1-6细胞与JS-1细胞在芯片中共培养。由于芯片中存在微柱阵列，两种细胞可在不同的芯片通道中增殖（图2A）; 细胞接种2天后，荧光显微镜扫描显示， 两种细胞均可在芯片中增殖生长（图2B）。

    3.3?氧气梯度下的药物作用

    本研究采用Calcein-AM/PI双染法对抗肿瘤药物紫杉醇、TPZ的细胞毒性进行表征。TPZ是一种对氧气敏感的抗肿瘤药，在氧气浓度较低时对肿瘤细胞的作用更明显[35]。

    在进行芯片抗药性实验之前，使用孔板MTT法对药物浓度进行初步筛选，结果如图3A和3B所示。当TPZ浓度为100 μmol/L时，细胞存活率接近50%，而紫杉醇在24 h内对细胞的毒性不大。由于高浓度的紫杉醇容易析出，因此，分别使用100 μmol/L TPZ与50 μmol/L 紫杉醇进行后续芯片实验。芯片实验中，上述浓度药物作用24 h后，两种药物对Hepa1-6细胞与JS-1细胞的生长均有抑制作用（图3C和3D）。对于这两种药物，共培养均可增加Hepa1-6细胞的抗药性。缺氧条件下，Hepa1-6细胞杉醇作用下的细胞存活率大于常氧条件; 而对于TPZ则相反，缺氧组的肿瘤细胞存活率急剧下降至20%，这与TPZ的特性相符。上述结果表明，在进行药物筛选时，氧气浓度对抗肿瘤药物的药效的影响不可忽略。

    3.4?缺氧与共培养促进肿瘤细胞的抗药性

    由于Hepa1-6细胞在低氧下对紫杉醇具有抗药性，因此选取紫杉醇作为研究对象，采用免疫荧光染色法探究了Hepa1-6细胞产生抗药性的原因。在药物作用24 h后，对细胞进行免疫荧光表征。α-SMA是肝星状细胞活化的标志性因子，在肝纤维化中起到重要的作用。由图4A可知，与Hepa1-6细胞共培养的JS-1细胞的α-SMA表达较单培养显著上升，说明共培养时，Hepa1-6细胞通过旁分泌作用促进了JS-1细胞中α-SMA的表达，并且加速了肝星状细胞的活化与纤维化; 共培养缺氧组中，JS-1细胞的α-SMA表达较单培养显著上升，较共培养组略有上升，表明缺氧环境中的肿瘤细胞亦会影响肝星状细胞的活化。TIMP-1主要在活化后的肝星状细胞中表达，由图4B可知，共培养模式下，星状细胞中的TIMP-1高于单培养模式，表明共培养促进了星状细胞的活化; 与缺氧的肿瘤细胞共培养时，星状细胞中的TIMP-1显著高于非缺氧条件下的共培养组，提示缺氧的Hepa1-6细胞可促使JS-1细胞中TIMP-1表达的增加，显著加速了肝星状细胞的活化。TGF-β能导致肿瘤细胞的药物抵抗，由图4C可知，共培养组中肿瘤细胞的TGF-β蛋白的表达高于单培养组，表明星状细胞的旁分泌作用会影响肿瘤细胞对紫杉醇的抗药性; 而缺氧组肿瘤细胞的TGF-β蛋白的表达量最高，证明了缺氧与活化了的星状细胞均能增加肿瘤细胞中TGF-β的表达量，进而促进肿瘤细胞的抗药性。

    4?结 论

    利用微流控技术构建了一个体外的缺氧肿瘤微环境模型，利用此模型进行了抗肿瘤药物TPZ与紫杉醇的体外毒性研究，并对肿瘤细胞抗药性的相关蛋白进行了检测。结果表明，本方法建立的缺氧模型可产生稳定的氧气梯度，可用于构建体外的缺氧实验模型。药物实验研究表明，氧气浓度对于抗肿瘤药物的药效具有不可忽略的影响。在缺氧条件下，TPZ对共培养的Hepa1-6细胞毒性增大，但对于药物紫杉醇，缺氧会导致肿瘤细胞产生抗药性，这是由于缺氧及共培养使得抗药性细胞因子TIMP-1与TGF-β的表达升高，导致肝星状细胞活化，从而增强肿瘤细胞的抗药性。相比于常规的体外实验，本研究建立的缺氧-共培养模型更接近肿瘤的真实环境，可为体外药物筛选以及新药研究提供新方法。

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    Study on Drug Resistance to Tumor Cell in Oxygen

    Gradient and Co-culture Microfluidic Chip

    SUN Wei1， CHEN Yu-Qing1， WANG Ming-Fang1， WANG Yue-Rong1， ZHANG Min2， ZHANG Hong-Yang1， HU Ping*1

    1（Shanghai Key Laboratory of Functional Materials Chemistry， School of Chemistry and Molecular Engineering，

    East-China University of Science and Technology， Shanghai 200237， China）

    2（Shanghai Key Laboratory of New Drug Design， School of Pharmacy，

    East China University of Science and Technology， Shanghai 200237， China）

    Abstract?Tumor microenvironment is a complex system， and it is of great importance in development， invasion and metastasis of tumor. In this work， an in vitro tumor hypoxic microenvironment model was constructed using an oxygen gradient microfluidic chip. The microfluidic chip was composed of two parts： one was a serpentine shape channel to generate oxygen gradient by a chemical reaction， the other was a three-parallel channel for the co-culture of cancer cells （Heap1-6 cells） and hepatic stellate cells （JS-1 cells）. The oxygen gradient was made in cancer cells to simulate hypoxic tumor microenvironment， and then a drug-resistance study on paclitaxel and tirapazamine （TPZ） in hepa1-6 cells was performed and the potential reason of the drug resistance was analyzed by molecular mechanism. The result showed that the oxygen gradient was 2.3%-16.7% on chip. The Hepa1-6 cells expressed paclitaxel resistance in hypoxic condition， but cell viability was significant down due to the effect of TPZ. The results of immunofluorescence assay showed hypoxia and co-culture could promote the expression of TIMP-1 and TGF-β， induce the activation of JS-1 cell and then enhance the drug resistance of Hepa1-6 cell to paclitaxel.

    Keywords?Microfluidic chip; Tumor microenvironment; Oxygen gradient; Cell co-culture; Drug resistance

    （Received 30 September 2019; accepted 8 November 2019）

    This work was supported by the National Natural Science Foundation of China （No. 81973285）.