淫羊藿苷逆转胃癌细胞恶性表型的研究

    李姝　郝艳坤　李爽　邢春旭

    

    

    【摘要】目的 研究淫羊藿苷逆转胃癌细胞恶性表型结果。方法 使用淫羊藿苷粉剂、培养基、小牛血清、PKA试剂盒进行菌株培养试验，检测淫羊藿苷对侵袭力和PKA活性的影响。结果 浓度高的淫羊藿苷对于胃癌细胞的恶性表型影响更显著，结果显示，高浓度淫羊藿苷对胃癌细胞黏附性影响随着时间延长而逐渐增强，最高可达到（18.9±0.4），对胃癌细胞的迁移速度影响逐渐下降，最低为（1.27±0.22）μm/h，对胃癌细胞侵袭力影响结果显示，高浓度组穿模数为（45.23±0.56）个，各项结果都与对照组有明显差异（P<0.05）。结论 淫羊藿苷可以对胃癌细胞的黏性、迁移速度和侵袭力进行控制，有利于逆转胃癌细胞的恶性表型。

    【关键词】胃癌细胞;淫羊藿苷;侵袭力

    【中图分类号】R735.2 【文献标识码】A 【文章编号】ISSN.2095.6681.2020.20..02

    中药淫羊藿苷主要是通过抑制肿瘤细胞黏附与运动而产生抗肿瘤转移功效的一种药物[1]。临床上发现，淫羊藿苷对胃癌细胞株细胞的黏附性与运动性信号分子蛋白激酶A会产生一定的影响，本文就此展开淫羊藿苷逆转胃癌细胞恶性标案的作用与机制研究，具体如下。

    1 资料与方法

    1.1 一般资料

    选择上海友思生物技术有限公司生产的淫羊藿苷粉剂，Hyclone公司研发的培养基，Gibco公司生产的小牛血清与Promega公司生产的PKA试剂盒。

    1.2 方法

    将细胞株放置到10%小牛血清培养液中，培养液中含有100 mg/L的青霉素与链霉素，将培养菌株放置到37摄氏度，浓度为5%的二氧化碳饱和湿度培养箱内培养备用。

    用0.25%的胰酶消化对数生长期的胃癌细胞，灭菌PBS稀释离心去上清后培养基重悬细胞计数。将胃癌细胞浓度调整为106/ml后按照每孔90 μL的种板规格培养24 h，并分为对照组、低浓度组（100 mg/L）、中浓度组（200 mg/L）和高浓度组（400 mg/L），加入浓度不同的淫羊藿苷培养液进行培养，每孔设6个复孔，分别在12 h、24 h、36 h和48 h收获。使用离心机设备分离上清，并以0.25%的胰酶消化，每孔加入90 μL的培养基重悬细胞，加入MTT20 μL，设置隐形对照。在37设施度的环境下连续孵育4 h，每孔加入0.04 mol/L的DMSO，共计100 μL。吸管反复吹打成接近结晶颗粒，溶解后使用酶联免疫检测仪进行密度值测量，波长设定为490 nm。

    1.3 观察指标

    （1）侵袭力测定：使用Matrigel胶重建基底膜，并以体外研究的方式，测定肿瘤细胞的侵袭与转移行为，以更加简单和快速的方式，获取侵袭力结果。加入Transwell小室表面，并在室温下进行通风干燥过夜。应用前Matrigel无血清培养基重新构建20分钟之后备用，调整细胞的浓度，并加入600 μL、浓度为20%的小牛血清，在培养基内培养。使用甲醛固定30分钟之后，苏木素染色2至5分钟，并去除insert上方细胞。在显微镜下计算膜下面的细胞数，随机计数5个视野中的细胞数目，每个标本重复3次，实验重复2次，根据清晰细胞的相对数量，判断肿瘤细胞实际侵袭能力。

    （2）PKA活性测定：使用Promega公司生产的PT非放射性PKA活性检测试剂盒进行检验。分别取各组胃癌细胞5×106至1×107个，在冰上加入0.5 ml的PKA抽取液，同样采用反复吹打的方式，15分钟后收集提取液，进行5分钟的冷冻离心操作，收集上清液。使用考马斯亮蓝试剂盒定量总蛋白，按照试剂盒说明的检测方法对齊活性进行测定。

    1.4 统计学方法

    应用SPSS 20.0统计学软件进行数据分析，计量资料（x±s）表示，t检验;计数资料以（%）表示，x2检验。P<0.05即为差异有统计学意义。

    2 结 果

    2.1 淫羊藿苷对胃癌细胞的黏附性影响

    经过淫羊藿苷处12小时之后，胃癌细胞在I型胶原上的黏附40分钟开始，黏附率明显降低，并且这种黏附抑制作用会随着时间的延长而不断延长。见表1。

    2.2 淫羊藿苷对胃癌细胞迁移影响

    对照组的迁移速度为（2.28±0.31）μm/h，低浓度组为（2.01±0.24）μm/h、中浓度组为（1.96±0.21）μm/h，高浓度组（1.27±0.22）μm/h。各组与对照组相比，差异结果显著，均有统计学意义（P<0.05）。

    2.3 淫羊藿苷对胃癌细胞侵袭力的影响

    对照组穿模细胞数为（137.32±0.32）个，低浓度组为（102.03±0.64）个、中浓度组为（68.35±0.55）个，高浓度组（45.23±0.56）个。各组与对照组相比，差异结果显著，均有统计学意义（P<0.05）。

    3 讨 论

    综上所述，胃癌属于消化道恶性肿瘤疾病，受到其浸润性和转移性因素的影响，临床治疗工作效果并不理想。通过研究发现，胃癌肿瘤细胞的黏附、运动能力和侵袭性是其出现转移和浸润的主要原因。本文研究得出，淫羊藿苷对于胃癌肿瘤细胞的恶性转移有抑制作用，且这种效果与淫羊藿苷细胞活性有关。胃癌发病隐秘、发展迅速并且死亡率很高，很多时候临床上确诊时就已经属于中晚期，失去手术时机，只能依靠放化疗缩小肿瘤，副作用较大[2]。近几年，多西紫杉醇、替吉奥、卡培他宾等药物对于全身性抗癌治疗有较好的效果[3]。现代肿瘤治疗已经突破了传统治疗手段存在的杀伤指数小、抗癌能力低和不良反应明显等问题，淫羊藿苷作为新型绿色抗癌药物，根据不同肿瘤分期和患者的实际情况，在治疗期间可以发挥出扶正培本、活血化瘀等优势，实现中西医结合特色治疗方法和有针对性的个体化治疗，对于肿瘤治疗有较好的效果[4-5]。

    参考文献

    [1] 杨轶舜，吴华燕，宋泽家.3种淫羊藿苷次生产物的制备及HPLC测定[J].中成药，2020，42（03）：779-782.

    [2] 章晓云，张 驰，宋世雷.基于网络药理学和蛋白模块分析淫羊藿治疗骨关节炎的作用与机制[J].中国组织工程研究，2020，24（17）：2660-2666.

    [3] 陈素华，马天江，张智慧.淫羊藿苷通过下调转移相关蛋白2抑制MGC803细胞的增殖、迁移和侵袭[J].基础医学与临床，2019，39（11）：1587-1591.

    [4] 鞠 静.淫羊藿苷和宝藿苷I对气管切开大鼠早期肺部炎症及免疫指标的影响[D].广西医科大学，2019.

    [5] 刘小菊，张美芝，陈 丹.淫羊藿苷防治恶性肿瘤作用机制研究进展[J].河北中医，2018，40（11）：1748-1752.