基于空芯光纤-衰减全反射傅里叶变换红外光谱技术的骨关节炎不同病期的有监督识别

    赵远 朱勇康 陆燕飞 尚林伟 符娟娟 马丹英 王潇 尹建华

    

    

    

    摘?要?衰减全反射傅里叶变换红外光谱技术（ATR-FTIR）可实现微量样本的快速可靠的在体红外光谱检测。本研究采用自行搭建的空芯光纤（HOF）ATR-FTIR探针技术，结合主成分分析（PCA）及Fisher判别（FDA）算法，对不同病变阶段（健康，病变8周、3個月、7个月）比格犬的骨关节炎（OA）离体样本进行原位鉴别分析。对初始样本识别正确率为100%;各组分别选取一独立样本作为预测组，预测组样本识别正确率为100%;所有交叉验证的识别率均超过95%。本方法能客观地准确鉴别不同病变阶段的OA样本，可作为不同OA病变阶段的诊断参考。结合主观的OA评分结果，HOF-ATR-FTIR技术在OA的在体原位临床诊断中具有重要的应用价值，有望为OA提供更加客观精确的光谱分级和分期结果。

    关键词?骨关节炎; 空芯光纤-衰减全反射傅里叶变换红外光谱; 主成分分析; Fisher判别

    1?引 言

    骨关节炎（OA）是由生物因素和机械性损伤相互作用引起的一系列病理生理变化进而产生的生物力学紊乱所致[1]，在OA的治疗中，最为关键的是对OA实现早期诊断、早期预防、早期治疗。临床上OA诊断分级的经典手段包括Kellgren和Lawrecne的放射学诊断标准[1，2]、美国风湿病学院提出的X线/临床加X线诊断[1]等; 实验室中常根据关节软骨的病理损伤作为OA病变评分/分级的“金标准”，常用的有Mankin评分（HHGS评分）[1，3～5]、OARSI osteoarthritis cartilage histopathology assessment system（OOCHAS评分）[1～3，6]等。然而这些方法或不能在发病初期诊断出不易被察觉的软骨基质的毁坏和不明显的机械伤害，或难于对软骨基质实现原位探测，且受主观因素影响较大，因此发展有效的OA监测和诊断技术方法对OA的研究及临床诊疗有着重要意义。

    针对OA的诊断除了影像学检查（X线检查、CT检查、磁共振检查、超声学检查、核素扫描等[1]）、生化手段检查（血液检查、尿液检查、关节滑液检查等[1]）外，越来越多的研究采用傅里叶变换红外（FTIR）光谱技术[7～11]。通过FTIR光谱技术，可从分子水平对样本的变化进行研究。衰减全反射（ATR）技术则是适用于小面积、小体积测量的光学技术，且对样品预处理没有特殊要求[12～17]。自20世纪90年代初开始，其被引入到FTIR光谱学，特别是进一步与光纤联用[14]，可准确、快速、灵活地应用于组织的原位红外光谱检测中，实现对微量样本的在体红外光谱检测，具有良好的临床诊断应用前景。

    在本课题组的同期研究中，将主成分分析（PCA）、Fisher判别（FDA）引入到FTIR成像对正常和病变关节软骨样本的识别研究[18，19]。FDA方法是一种可借助方差分析建立判别函数并对数据集进行快速分类识别的有监督算法，本课题组高准确率地实现了对正常和病变的关节软骨样本的识别，证明了PCA-FDA方法应用于OA离体切片诊断的可靠性及稳定性。但FTIR成像需要对样本进行切片后再进行光谱采集和成像，是非原位光谱测量。在近期研究中，本课题组开发出空芯光纤（HOF）ATR-FTIR联用技术，可用于软骨及OA的原位探测[14]。本研究将空芯光纤-衰减全反射傅里叶变换红外光谱（HOF-ATR-FTIR）技术与PCA-FDA方法结合，在获得不同病变阶段的离体原位OA样本的ATR红外光谱信息后，进行快速有监督分类识别，为OA临床前的原位定量分类和分期提供了参考。

    2?实验部分

    2.1?样本处理及关节炎评分

    实验所用样本均由江苏亚东实验动物研究院提供。选择8只健康比格犬，对其中2只的左后腿膝关节胫骨平台进行原位提取，从而获取健康样本;其余6只进行单后腿（左后腿/右后腿）的膝关节前交叉韧带横断手术[3]，以诱导OA病变发生。OA造模术后，6只模型犬分为3组，分别培养8周（8w-1 & 8w-2）、3个月（3m-1 & 3m-2）以及7个月（7m-1 & 7m-2）后，对其手术侧的后腿膝关节胫骨平台进行原位样本提取，使用生理盐水进行清洗以备用。样本的培育和取样遵循本单位和协作单位实验动物伦理学委员会要求。

    前文提及的OOCHAS评分标准是根据损伤深度及相应组织反应将OA分为0～6级，根据损伤范围的大小将OA分为0～4期，其分级与分期的乘积即为最终得分[3]。OOCHAS评分标准对OA早期的分期较为精细[3]，因此本研究按照此标准对每个样本进行评价，得到评分结果如表1所示。

    2.2?光谱采集及数据分析

    样本清洗后，将目标样本置于三维样本台上，采用自制的HOF-ATR探头[16]并耦合傅里叶变换红外光谱仪（Vertex 70，Bruker公司）对样本进行多点原位光谱采集（点位数如表1所示），其中光谱采集和光谱处理使用光谱仪配套的OPUS 7.0软件进行。表1中，样本8w-1、8w-2所检测点位中均包含半月板未覆盖区域的1个点以及半月板覆盖区域的4个点（其中均有1个明显损伤点）。样本3m-1、3m-2所检测点位中均包含半月板未覆盖区域的2个点以及半月板覆盖区域的4个点。样本7m-1（7m-2）所检测点位中包含半月板未覆盖区域的3（2）个点以及包含半月板覆盖区域的3（3）个点，其中样本7m-1对半月板未覆盖区域磨损严重位置补充检测1个点。样本Healthy-1、Healthy-2所检测点位中均包含半月板未覆盖区域的4个点以及半月板覆盖区域的5个点。光谱采集范围为4000～ 900 cm1，间隔4 cm1。

    对所检测的光谱数据使用OPUS 7.0软件进行基线校正后，先采用IBM SPSS Statistics 22软件对光谱数据进行PCA，再选择适当的主成分因子进行有监督FDA。FDA处理过程中，分别将样本8w-1、3m-2、7m-1、Healthy-1的光谱数据作为预测组，各自与本组剩余犬（数据）及其它组一起构成对应训练组。

    3?结果与讨论

    3.1?光谱分析

    图1为对健康（Healthy）和OA 犬关节软骨原位检测的HOF-ATR-FTIR光谱。3276 cm1谱带是Amide A带（NH键的伸缩）[20]，1749 cm1表示CO的伸缩振动（来自于软骨細胞中以及软骨细胞周围基质中的脂质）[21～24]，1338 cm1源自胶原的CH2振动[8，25]。Amide Ⅰ、Amide Ⅱ更多来自于胶原蛋白，而1079 cm1来自蛋白多糖（PG）[26]。软骨中Amide III带既不适用于软骨胶原蛋白的含量表征，也不适用于PG的含量表征[26，27]。

    健康和患关节炎7个月的犬关节软骨的特征谱带吸光度（积分面积）见表2。根据文献[8]，OA病变6个月（与本研究中病变7个月时的病理状况接近）时，关节软骨中以Amide I表征的胶原的含量变化不明显，因此，对比于健康关节软骨，OA关节软骨1/Amide I明显降低，表明受OA影响，软骨表层软骨细胞内及周围基质中的脂质含量减少，可能暗示着软骨细胞在逐渐的退变或凋亡。Amide I/Amide II相对强度降低（2.78Healthy→2.12OA），表明OA关节软骨表面胶原纤维的结构发生了改变[8]。1338 cm1/Amide II相对强度也降低（0.10 Healthy→0.05 OA），表明OA关节软骨表面胶原蛋白的完整性发生了改变[8]。1079 cm1/Amide I的吸光度增加表明，随着OA的发生，软骨表面PG的含量增加。文献[8]研究结果表明，病变6个月时，在软骨细胞附近基质内，PG的含量随着软骨的退变而增加，胶原的含量变化不明显，但胶原完整性下降; 同时受胶原结构变化影响，1338 cm1谱峰强度降低，本研究结果与之一致。此外，3276 cm1的含量发生变化的同时，肩峰的相对强度也明显改变，表明Amide A也可能受OA的影响发生了含量的变化。

    3.2?PCA-FDA

    表3所示为PCA主成分累计贡献率，可见经PCA降维，前4个主成分（包括胶原蛋白、蛋白多糖、水等成分[26]）的累计贡献率即超过90%（达到92.11%），因此选择前4个主成分因子进行FDA处理。

    以8w-1犬的原位光谱数据为预测组，FDA分类结果及训练组的交互验证结果如表4所示，训练组初始样本均全部正确识别; 预测组样本识别正确率为100%; 交互验证案例的总识别正确率为97.8%。对误判点进行分析发现，仅有的1个误判点来自样本8w-2软骨端面明显损伤点（图2B），表明此位置胶原结构可能受到破坏，软骨基质的成分和含量受到影响，导致被误判为OA 7个月样本。

    以样本3m-2犬的光谱数据为预测组时，训练组初始样本均全部正确识别; 预测组样本全部正确识别; 交互验证案例的总识别正确率为95.6%。对误判点进行分析发现，一个误判点来自样本8w-1软骨端面明显损伤点（图2A），类似上述样本8w-2，此位置胶原结构也可能受到破坏，故导致此位置被判断为来自病变7个月样本; 另一个误判点来自样本7m-2软骨端面相对正常位置（图2C），软骨的破坏程度相对整体而言较轻，导致将此位置被判断为来自病变8周样本。

    以样本7m-1犬的原位光谱数据为预测组时，训练组初始样本均识别正确率100%; 预测组样本正确率100%; 交互验证案例的总识别正确率为97.8%。对误判点进行分析发现，仅有的一个误判点来自样本8w-2软骨端面明显损伤点（图2B），与表4的FDA结果误判原因一致。

    以样本Healthy-1犬的光谱数据为预测组时，训练组初始样本的识别正确率100%; 预测组样本正确率100%; 交互验证案例的总识别正确率为95.2%。对误判点进行分析发现，一个误判点来自8w-1样本软骨端面明显损伤点（图2A），另一个误判点来自样本7m-2软骨端面相对正常位置（图2C），发生误判原因与以样本3m-2犬的光谱数据为预测组时的FDA结果误判原因一致。

    根据上述PCA-FDA分析结果，各训练组初始样本均可100%正确识别，且对各预测组也均可准确识别，考虑到本研究所用样本较少（每组2只犬），因此采用分组预测验证。分别以不同时期样本作为预测组时，交叉验证的总识别正确率均超过95%，对出现误差检测点分析发现：（1）病变8周样本误判为来自病变7个月样本（8w-1、8w-2）的检测点均为所在软骨端面明显损伤点，因为此位置胶原纤维结构受到破坏，导致使所在点的光谱特征更接近病变7个月组而发生误判; （2）病变7个月样本误判为来自病变8周样本（7m-2）的检测点为所在软骨端面相对正常位置，此位置胶原纤维结果相对完整，导致所在点的光谱特征更接近病变8周组，进而发生误判; （3）样本差异及过拟合也可能是导致误判发生的因素。综上可见，HOF-ATR-FTIR光谱技术结合PCA-FDA方法有能力对不同病变阶段的OA实现高精度分类鉴别。

    OOCHAS评分是基于对软骨损伤的深度和长度而进行综合评估（分级×分期）的一种半定量评价方法，总分24分。将评分 ≤ 12分（共10个档次）的样本归类为OA早期阶段，而将评分>12分（5个档次）的结果归类为OA中晚期阶段[3]。依此而言，本实验经膝关节前交叉韧带横断手术后培养的OA样本中，病变8周（OOCHAS评分2分）、3个月（OOCHAS评分4分）样本均处于OA早期[3]。客观而言，OOCHAS评分标准更适合对OA早期进行较精细的评级，而仅将中晚期划分为5个档次，无形中模糊了对OA中期的精确划分，将中期、晚期病变统一划入了中晚期的范畴，这也是表1中病变7个月样本（OOCHAS评分18分）被误判为OA中晚期的原因。

    相对于半定量的OOCHAS评分方法，基于组织切片病理染色的Mankins 评分标准更适用于对OA中晚期的评价 [3]，两种主观评分方法互补，可对OA的早中晚分期进行较均匀、全面的主观评价。采用本研究建立的HOF-ATR-FTIR & PCA-FDA定量判别技术，必要时联合内窥镜技术进行在体原位探测，通过采集和丰富不同病变（分期）阶段的OA光谱数据库，或联用其它诊断工具，在主客观评判方法之间建立相关联数据库，将有望对疑似OA患者进行更客观快速的分级/分期在体原位诊断。

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