基于三维石墨烯-普鲁士蓝构建电化学酶传感器用于尿酸的灵敏检测

    李鹏威 张尧 李庆莲 高攀 贾能勤

    

    

    

    摘?要?构建了一种基于三维石墨烯（3D GR）-普鲁士蓝（PB）的电化学酶传感器，用于尿酸的灵敏检测。采用一步水热法将氧化石墨烯热还原，自组装形成3D GR，再将PB电沉积到3D GR上，形成3D GR-PB复合物。3D GR具有大的比表面积和多孔特性，可为反应提供更多的活性位点。电化学测试表明，基于3D GR-PB构建的酶传感器检测尿酸具有较宽的线性范围（3.75×109 ～3.75×104 mol/L）和较低的检出限（4.21×1010 mol/L）。由于尿酸酶对催化尿酸的高度专一性，本传感器具有较高的选择性，为尿酸的灵敏检测提供了一种可行的方案。

    关键词?三维石墨烯;?普鲁士蓝;?尿酸;?电化学酶传感器

    1?引 言

    尿酸（UA）存在于人尿液、血清、血浆和唾液中，是人体中嘌呤的正常代谢产物[1～3]。血液中的尿酸含量被作为检测白血病、肺炎、高血脂、高血糖等疾病的标志物。血液和尿液中尿酸的正常水平分别为0.13～0.46 mmol/L （2.18～7.7 mg/dL）和1.49～4.46 mmol/L（25～74 mg/dL）[4]。因此，准确检测尿酸的含量用于疾病诊断具有重要意义。

    目前，用于检测尿酸的分析方法主要包括高效液相色谱法[5]、荧光法[6]、化学发光法[7]等，尿酸的临床常规检测方法有酶紫外法和酶比色法。这些方法耗时，且样品前处理较复杂。因此，需开发简单、快速、灵敏和准确的尿酸检测方法。生物传感器因其高特异性、高灵敏度、快速响应、低成本、简便的样品制备方法等特点，在生物检测领域引起了广泛关注[8～17]。电化学生物传感器是一种对生物物质敏感，并将其浓度转换成电信号进行检测的装置，是一种固定化的生物敏感材料系统，用于识别组分（包括抗体、酶、抗原、细胞、组织、核酸、微生物和其它生物活性物质）和相应信号的传感器。对于目标物的分析检测，需对生物传感器的电极进行功能化修饰，以提高体系的传感性能。通过在电极上修饰酶，可提高传感器的选择性; 为提高传感器的灵敏度和响应强度，可在电极上修饰导电性好的多孔纳米材料，如三维石墨烯（3D GR）泡沫。目前，关于3D GR电化学传感器检测UA的报道较多[18～21]。 Yue等[19]以泡沫镍为模板合成3D GR，随后蚀刻镍，对UA的选择性有所改善，但实验条件过于苛刻。Wang等[20]以镍粉为原材料，采用化学气相沉积方法合成3D GR，电化学方法检测多巴胺和UA，但合成3D GR的过程复杂，不易操作; 同时，选择性较差，线性范围较窄，灵敏度较低。Chen等[21]将尿酸酶固定在碳纳米管上，用于检测细胞中的UA，构建的生物传感器表现出快的响应速度（～2 s）、低的检出限和宽的线性范围。

    石墨烯是一种原子厚度的二维碳材料，具有高机械强度、高导电性和导热性[22～24]、大比表面积和较高的稳定性，并在传感器[25]、催化[26]、能量存储设备[27，28]和环境领域具有较好的应用潜力。然而，石墨烯的应用还需将石墨烯组装成各种各样的宏观结构。3D GR是氧化石墨烯（GO）在还原过程中通过自组装形成的三维结构[29～31]。3D GR不仅保留了石墨烯优异的机械、热学和电学性能，而且具有三维多孔结构、低密度、良好导电性和高比表面积等优点，因而，在能量储存、催化、柔性传感器等方面具有很大的应用潜力。普鲁士蓝（PB）作为分析应用中常用的电化学介质，已广泛应用于生物传感器领域，其催化H2O2还原的性质已被用于构建多种基于氧化酶的生物传感器，进而用于临床、环境和食品等领域的检测分析[32～35]。

    本研究构建了一种基于三维石墨烯-普鲁士蓝（3D GR-PB）的电化学酶传感器，用于检测UA。3DGR具有较高的比表面积和多孔结构，可为PB提供更多的附着位点，同时也为尿酸酶的催化作用提供较多的活性位点[36～38]。本传感器具有灵敏度高、选择性和稳定性好的优点，对于UA的快速灵敏检测具有潜在的应用价值。

    2?实验部分

    2.1?仪器与试剂

    ZEISS ULTRA 55扫描电子显微镜（德国卡尔蔡司公司）; CHI 660b电化学工作站（上海辰华仪器公司）; Micromeritics TriStar II 3020比表面积测试仪（美国麦克仪器公司）。

    尿酸酶（20 U/mg，百灵威科技有限公司）; UA（≥98%，上海源叶生物科技有限公司）; GO（99.5%，1～3层，上海阿拉丁生化科技有限公司）; 壳聚糖 （98%，分子量161.16）、无水乙醇（95%）、无水FeCl3（>98%）、K3Fe（CN）6 （≥99.5%）、K4Fe（CN）6（≥99.5%）、KCl（99.99%）、KH2PO4（99.99%）、Na2HPO4（99.5%），均购自上海化学试剂公司。Na2HPO4和KH2PO4用于配制磷酸盐缓冲溶液（0.1 mol/L PBS，pH=7.4），缓冲液亦作为电解液。 所有试剂均为分析纯，实验用水为超纯水。

    2.2?3D GR的制備

    采用一步热还原的方法制备3D GR[39]。合成步骤如下：将40 mg GO分散在20 mL水中，超声10 min使之分散均匀，形成2 mg/mL的分散液。将分散液转移到高压水热反应釜中，160℃烘箱中反应12 h，冷却至室温，将得到的固体冷冻干燥，最终产物即为3D GR。

    2.3?三维石墨烯-普鲁士蓝（3D GR-PB）的制备

    将3D GR修饰的电极浸入新配制的5 mmol/L K3[Fe（CN）6]、5 mmol/L FeCl3、1 mol/L KCl溶液中，在0.2～1.2 V的电压范围内，三电极体系（工作电极：3D GR-PB修饰的玻碳电极; 参比电极：饱和甘汞电极; 对电极：铂电极）下循环伏安扫描20圈[40]，扫速为20 mV/s。用水冲洗掉未聚合的浮层。将3D GR-PB修饰电极置于0.01 mol/L K2HPO4/KH2PO4-0.1 mol/L HCl缓冲溶液（pH=6）中。在扫描电位为0.2～1.1 V，扫速为50 mV/s的条件下，进行PB的循环伏安特征峰扫描，用于验证PB是否成功电聚合到电极上。检测电聚合成功后，用水冲洗电极，在空气中干燥后，备用。

    2.4?基于3D GR-PB电化学酶传感器的构建

    如图1所示，将5 mL（2 mg/mL）3D GR溶液滴在玻碳电极上（直径3 mm），37℃烘箱中干燥。将此修饰电极浸入到新配制的5 mmol/L K3[Fe（CN）6]、5 mmol/L FeCl3、1 mol/L KCl混合溶液中，在0.2～1.2 V的电位和20 mV/s扫速下循环扫描20圈。将5 μL尿酸酶（0.05 mg/mL）溶液滴涂在电极上，37℃干燥12 h。最后，将5 μL壳聚糖溶液滴在电极上，利用壳聚糖良好的成膜性能，将上述材料牢固固定在电极上。

    2.5?UA的分析检测

    在0.1 mol/L PBS缓冲液中，使用3D GR-PB修饰电极，采用差分脉冲伏安法（DPV）对UA进行检测。构建的电化学酶传感器反应机理如下：UA在尿酸酶的作用下产生H2O2（方程式1），此时，PB催化H2O2，在这个过程中产生电子并发生电子的转移（方程式2和3），产生电信号。随着UA浓度的增加，H2O2的生成量随之增加，同时PB催化H2O2产生电子的数目也会增加，电流响应强度逐渐增强，从而实现对UA的定量检测。实际样品检测中，首先将人血清加入到0.1 mol/L PBS缓冲液中，然后加入不同浓度的UA溶液，测定响应电流（扣除加入血清时的电流响应强度）。具体反应过程如下：

    3?结果与讨论

    3.1?3D GR和3D GR-PB的表征

    从图2A～2C可见，3D GR具有多孔网状的结构且孔径分布较均一，粒径约5 μm。图2A插图是合成的3D GR，与文献报道的形貌一致[41～46]。在3D GR修饰的电极上电沉积PB后，3D GR负载了很多PB纳米颗粒（图2D～2F），粒径分布比较均一，尺寸大小相同，但PB有团聚现象，这可能是由于在电沉积过程中电沉积的扫描速度、扫描圈数及溶液浓度不同引起的。

    在图3A的拉曼光谱图中，1348和1581 cm1处的峰分别对应于3D GR的D峰和G峰，峰位发生偏移，说明G峰不够尖锐且强度较低，而且D峰强度超过G峰强度，使得ID/IG值变大（ID/IG值的大小表示石墨烯的缺陷密集程度，比值越大，缺陷程度越大），表明 3D GR多孔结构不规则。这是由于在制备GO时强氧化剂的加入使得原有规则排列的石墨片层之间引入了较多的含氧官能团和悬挂键，导致产生大量缺陷，以及碳的sp2杂化转化为sp3，破坏了石墨的结晶性能，当GO被还原后，这些缺陷仍会部分存在，所以在拉曼图谱中，3D GR的D峰强度超过G峰强度[47，48]。2091和2157 cm1 处的峰对应于PB中CN基的伸缩振动峰[49]，当PB修饰到3D GR上之后，产物既有3D GR本身的特征峰，又有PB的特征峰，证明PB电沉积成功。将电极在0.1 mol/L PBS溶液中进行CV测试（图3B），发现其在0.2和0.9 V各有一个特征峰[50]，对应于PB的氧化还原峰，具体的反应过程如下：

    由BET测试结果（图4A）可知，GO的比表面积为3.68 m2/g，3D GR的比表面积为199.12 m2/g，表明3D GR具有较高的比表面积。由GO和3D GR的孔径分布图（图4B）可知，3D GR的孔径约为3 nm，GO不具有孔状结构。

    3.2?传感器组装过程的电化学表征及定性实验

    采用循环伏安法和电化学阻抗表征了传感器的组装过程。如图5A所示，与裸玻碳电极（曲线c）相比，由于3D GR具有良好的导电性，能够促进电子的转移，修饰3D GR后，电极的电流响应增强（曲线b）。由于PB也具有良好的导电性，当在电极上电沉积PB后，电流响应进一步增强（曲线a）。酶和壳聚糖导电性差，所以当电极分别修饰上尿酸酶（曲线d）和壳聚糖（曲线e）后，电流响应均减弱。图5B的阻抗图中，高频区的半圆直径对应电极的电子转移阻抗值Ret。与裸玻碳电极（曲线c）相比，在电极上修饰3D GR（曲线b）后，Ret变小; 继续修饰PB，Ret继续减小（曲线a））; 在电极上修饰上尿酸酶（曲线d）和壳聚糖（曲线e）后，Ret逐渐增大。从图5A中电流响应强度和图5B中Ret的变化可知，此酶传感器组装成功。

    考察了修饰电极对H2O2的电催化作用，结果如图5C所示。随着H2O2浓度增加，PB的还原峰的峰电流强度逐渐增强，表明PB能够催化H2O2还原。随着UA浓度的增加，还原峰电流响应强度增强（图5D），表明构建的酶传感器可用于UA的检测。

    3.3?实验条件优化

    对检测UA的实验条件（包括底液的pH值、尿酸酶的浓度等）进行了优化。如图6A所示，随着底液（0.1 mol/L PBS缓冲液）pH值增大，电流响应强度增加，并在pH=5时达到最大。当pH值继续增大时，电流响应强度减小，因此选择最佳pH=5。从图6B可见，随着尿酸酶浓度增加，电流响应强度增加，当尿酸酶浓度为0.05 mg/mL时，电流强度最强，继续增加其浓度，电流响应强度反而减小，所以尿酸酶的最佳浓度为0.05 mg/mL。

    3.4?3D GR-PB电化学酶传感器对UA的检测性能

    圖7A是3D GR-PB/GCE在0.1 mol/L PBS缓冲溶液中对不同浓度UA的DPV曲线，随UA浓度升

    高，还原峰电流响应强度依次增加，如图7B所示，在3.75×109～3.75×104 mol/L浓度范围内，UA浓度的对数与电流响应强度呈线性关系，I=1.153lgC-43.057（R2=0.991），检出限（S/N=3）为4.21×1010 mol/L。相比于文献报道的检测UA的方法（表1），本研究构建的电化学酶传感器具有较宽的线性范围以及较低的检出限。

    考察了多巴胺、抗坏血酸、葡萄糖等潜在干扰物对UA测定的干扰。在0.1 mol/L PBS缓冲液中分别加入多巴胺（3.75×105 mol/L）、抗坏血酸（3.75×105 mol/L）和葡萄糖（3.75×105 mol/L）后，还原峰电流几乎没响应; 当加入UA（3.75×105 mol/L）后，还原峰电流具有较高的响应，由此可知，此传感器具有较强的抗干扰能力。为了检验3D GR-PB基电化学酶传感器的稳定性，将传感器在0.1 mol/L PBS中进行多次循环伏安扫描测试，还原峰的峰电流和峰电位都未发生偏移，可知此传感器具有较好的稳定性。

    3.5?血清樣品中UA的检测

    采用本方法测定了人血清中的UA浓度。人血清中UA的标准添加实验结果如表2所示，回收率在99.4%～102.8%之间，表明此传感器检测血清样品中UA的准确性高，可用于实际样品中UA的灵敏检测。

    4?结 论

    构建了一种基于3D GR-PB的电化学酶传感器，实现了对UA的灵敏检测。由于尿酸酶对催化UA具有高度专一性，使得此传感器具有较高的选择性以及较强的抗干扰能力。采用高比表面积的多孔3D GR作为基底材料，能提高修饰电极的电子转移速率。与其它方法相比，本研究构建的电化学酶传感器检测UA具有较宽的线性范围和较低的检出限。此3D GR-PB电化学酶传感器为UA的快速灵敏检测提供了一种可行且有效的方法。

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