小鼠活体脑部生物活性分子的荧光成像研究进展
王昕 李平 张雯 唐波
摘?要?大脑在分子水平上具有独特的化学组成和反应活性。脑部的生物活性分子（包括金属离子，活性氧物种，神经递质及神经递质水解酶等）在脑功能的行使过程中，扮演着不同却又极其关键的角色。正常稳态浓度的生物活性分子对维持稳定的脑部和功能发挥了重要作用，而生物活性分子水平的异常变化又与帕金森病、阿尔兹海默症、抑郁症等多种脑部疾病的发生与发展密切相关。因此探究大脑中生物活性分子的浓度及调控作用，对揭示大脑的奥秘、理解脑部疾病的发生和发展具有重要作用。荧光成像方法具有高灵敏、高时空分辨、易操作等优势，是探究大脑中生物活性分子的真实浓度和功能的重要工具。近年来，随着荧光成像技术的发展，研究者构建了多种荧光探针用于检测鼠脑中生物活性分子。本文综述了近年来用于大脑中生物活性分子检测的分子探针、纳米探针及蛋白探针的发展概况，探讨了构建新型荧光探针、利用荧光成像方法进一步深入剖析生物活性分子调控大脑功能等方面的研究，对未来的发展进行了展望。
关键词?荧光探针; 脑部成像; 生物活性分子; 评述
1?引 言
大脑作为神经系统最高级的器官，是认知和运动功能的指挥中心，具有独特和复杂的物质结构[1]。在分子水平上，大脑该特殊的器官具有独特的化学组成和反应活性[2]。大脑的化学组成复杂，而且大脑的物质组成中包含着許多独特的分子，其中许多只存在于神经系统中。这些不同的分子对于脑功能的行使，扮演着不同却又非常关键的角色[3]。例如，大脑中的金属离子（Ca2+＼， Cu2+＼， Zn2+＼， Fe2+等）对维持生物分子结构的稳定性和功能发挥了重要的作用[4]，包括核酸折叠、转录、催化、离子通道和传递信号等;神经递质（5?羟色胺、多巴胺、乙酰胆碱等）在突触传递中承担着“信使”的角色，维持神经元彼此之间的相互通讯联系等[5，6]。但是，生物活性分子水平的异常变化又与帕金森病、阿尔兹海默症、抑郁症等多种脑部疾病的发生与发展密切相关。 研究发现， 帕金森病（PD）患者脑中Fe2+含量增加[7]，进而导致氧化应激的发生和活性氧物种（ROS）的爆发[8];抑郁症患者脑中神经递质5?羟色胺含量下降[9];阿尔兹海默症（AD）患者脑部Aβ淀粉样蛋白含量显著增多[10，11]等。因此，准确检测大脑中生物活性分子的浓度并深入探究其在大脑中的功能及相关调控机制，对揭示大脑的奥秘、阐明脑部疾病的病理机制显得尤为重要。
目前， 用于脑部成像的方法有计算机X线断层摄影（CT扫描）[12]、正电子发射断层扫描术（PET）[13]、磁共振成像（MRI）及血管造影术[14]等。然而，上述方法均无法实现实时示踪活性分子浓度变化。由于荧光成像方法具有高灵敏、高时空分辨、易操作等优势，原位荧光成像分析方法已成为目前实现对大脑中生物活性分子的真实浓度检测和功能探究最理想的手段[15～17]。而该方法的核心技术是构建可用于大脑中特异性检测的荧光探针。因此，近年来，众多课题组设计合成了多种荧光探针，并用于检测小鼠神经元和大脑中的金属离子、活性氧物种、神经递质及神经递质水解酶等[18]。本文从被检测的生物活性分子出发，综述了近年用于大脑中生物活性分子检测的分子探针、纳米探针以及蛋白探针的发展，并在构建新型荧光探针、利用荧光成像方法进一步深入剖析生物活性分子调控大脑功能等方面进行探讨与展望。
2?检测金属离子的荧光探针
在过去的几十年里，研究者陆续发现细胞/组织中金属离子的异常稳态与多种疾病有关，如神经退行性疾病，癌症和糖尿病等。虽然它们在疾病病理中的确切作用尚不清楚，但越来越多的疾病已被定性为金属离子失衡相关的疾病[4]。如神经退行性疾病脑组织中存在Cu2+、Zn2+、Fe2+等转运金属离子的异常积累[19]。Cu2+水平升高已被证明与阿尔兹海默症有关。在抑郁症患者的外周血内也发现了Zn2+和Cu2+浓度的异常变化。帕金森病患者脑中的Fe2+含量增加。因此，在活体、细胞中，甚至在单个细胞器和亚细胞间隔的水平上，精确监测金属离子的浓度，进而探究其功能，对于理解这些疾病和发展诊断方法至关重要。
2.1?检测Zn2+的荧光探针
Zn2+的金属?神经化学是当前研究的热点。Zn是人脑中第二丰富的d区金属，在海马区中含量较高。脑内的Zn2+存在类型通常分为两种：蛋白结合型和松散结合型，后者也被称为流动型锌。目前，流动型锌的神经生理学和神经病理学意义尚不清晰。由于Zn本身不具有典型的光谱特征，因此，探究Zn2+在大脑内的分布、迁移和功能，就需要发展具有高选择性、时空可分辨的荧光成像工具[20]。
Li等[21]设计并合成了一种基于分子内电荷转移的双光子比率荧光探针（探针1），并将其用于活细胞、海马组织和斑马鱼内Zn2+的成像分析。 探针1可快速、高选择性识别Zn2+，并且具有高的双光子吸收截面和量子产率。探针1的初始发射峰在465 nm处，随着Zn2+浓度的增加而下降，初始发射峰的荧光强度逐渐降低，同时在550 nm处生成一个新的发射峰，且荧光强度逐渐增强，这使得探针1对Zn2+的比率检测具有较高的准确度。而且探针1可进行荧光寿命成像，并准确地反映Zn2+在单细胞水平上的分布。由于探针1拥有双光子荧光深层组织穿透的显著优势，成功地对小鼠大脑组织切片和斑马鱼中Zn2+进行了深度成像，并揭示出AD小鼠海马组织中Zn2+水平高于正常小鼠。该探针具有快速响应，高选择性，优异的双光子性质等优点，为探究Zn2+在活体中的分布和功能提供了有力的成像工具，对阐明Zn2+在脑内相关生理和病理过程发挥的作用具有重要意义（图 1）。
为研究神经元溶酶体内Zn2+的功能，Zhu等[22]报道了一种靶向溶酶体、比率检测Zn2+的探针（探针2）。探针2以BODIPY染料为母体，以二甲基吡啶胺（DPA）为Zn2+识别基团，以吗啉基团为溶酶体的靶向基团。根据软硬酸碱理论，BODIPY荧光团上的间位给电子基团使该探针更倾向于与Zn2+络合，而不是与Cd2+络合，大大提高了探针的选择性。与Zn2+结合后，探针2在578 nm处的荧光强度明显增强，578/680 nm处荧光强度的比值也发生变化。细胞共聚焦成像实验表明，探针2可定位到神经干细胞（NSCs）、MCF?7细胞和Hela细胞的溶酶体中，并可实现NSCs内外源性Zn2+的检测。此外，通过双发射比率成像，探针2还成功地用于检测H2O2刺激下NSCs中溶酶体内Zn2+的释放。因此，基于高选择性、细胞器靶向、双发射比率成像的优势，探针2可作为一种潜在的工具洞察大脑中Zn2+在多种神经系统疾病发病机制中发挥的作用（图 1）。
Lee等[23]开发了一种新型双光子荧光探针（探针3），用于选择性检测多种生物过程中溶酶体内的Zn2+变化。作者将溶酶体的定位基团吗啉分子和Zn2+配体DPEN引入萘甲酰亚胺荧光染料中。探针3的最大吸收峰在450 nm处，只有在溶酶体pH值下，且Zn2+存在时才有荧光，该设计极大地提高了探针的选择性和定位能力。在900 nm的激发光波长下，探针3可对小鼠大脑溶酶体内较低浓度的Zn2+进行可视化研究，探针3为探究溶酶体内Zn2+调控的多种生物事件的分子机制提供了有效的双光子成像工具（图 2）。
Zn2+在谷氨酸能神经元突触前囊泡中累积，并且在神经兴奋时随谷氨酸的释放而释放。为了在突触水平上理解Zn2+的时空调控，Khan等[24]利用一种Zn2+响应荧光探针（探针4）和双光子荧光显微镜实现了对成年小鼠海马切片齿状回神经元苔藓纤维端NMDA受体依赖性长期电位介导的Zn2+动态成像。探针4以荧光素为母体，共价偶联了两个Zn2+的结合位点。在荧光素母体结构上引入五氟苄基，是为了增加探针的pKa，从而改善pH值改变对探针荧光的干扰情况，此外，引入的两个羧基增加了探针的膜渗透性。基于该探针良好的膜渗透性和优异的双光子性能，利用探针4孵育海马苔藓纤维端突触前囊泡，可观察到由于KCl诱导去极化后引起的细胞内吞和囊泡修复，因而导致的单个神经元突触前的Zn2+信号降低的现象，表明突触电位增强时Zn2+从囊泡释放。这種突触水平的双光子Zn2+成像方法可监测突触前Zn2+的动态变化，有助于加深对Zn2+在正常和异常神经功能中的生理作用的理解。该方法将进一步促进关于Zn2+恢复突触可塑性和其它神经功能的研究（图 2）。
基于荧光团的推拉电子效应，Bourassa等[25]Fahrni课题组开发了一种具有膜透性的Zn2+荧光探针（探针5）。探针5在与Zn2+反应前后具有明显的荧光光谱位移，适用于荧光发射比率成像。探针5的Kd=1.5 nmol/L，对Zn2+展现出了较强的结合能力，可用于观察小鼠成纤维细胞中Zn2+水平随时间的变化情况。探针5具有优异的双光子荧光成像能力，尤其适合于在多种生理和病理条件下探索活细胞中Zn2+池的作用。他们使用探针5监测细胞不同发育阶段的少突胶质细胞细胞质中游离的Zn2+浓度。细胞成像实验发现了成熟的少突胶质细胞分化时探针荧光强度的降低，表明在细胞成熟过程中，细胞内Zn2+浓度整体降低。此外，双光子比率荧光成像有利于观察少突胶质细胞的分化过程中Zn2+的细微变化。在发育的少突胶质细胞内，细胞质Zn2+的浓度范围是135～152 pmol/L，而在成熟的少突胶质细胞内，Zn2+的浓度在65～95 nmol/L范围内，比发育过程中Zn2+的浓度低了近2倍，这是首次利用双光子比率荧光成像监测到了细胞分化过程中Zn2+的变化。因此，探针5具有比率荧光成像的优势，以及可视化Zn2+稳态变化的能力，为探索调控Zn2+稳态和Zn2+信号传导提供了有效手段（图 2）。
Peng等[26]通过组装掺镧的上转换纳米粒子（UCNPs）合理设计和构建了快速灵敏检测水溶液中Zn2+的荧光传感平台（探针6）。以聚丙烯酸和化合物1构建多层UCNPs，以NaYF4：Yb/[email protected]为能量供体，具有Zn2+反应性的化合物1为能量受体，化合物1通过荧光共振能量转移（FRET）猝灭UCNPs的上转换发光（UCL）。化合物1与Zn2+结合后，抑制了FRET，UCNPs荧光恢复，从而实现Zn2+的定量监测。探针6具有良好的光物理性能，较高的灵敏度（检出限为0.78 μmol/L）、较快的反应速度（反应时间小于5 s），优良的生物兼容性等优点，可适用于AD脑组织切片和斑马鱼淀粉样斑块中Zn2+的体内、体外检测。该纳米传感系统为临床医学中与Zn2+相关的疾病诊断提供了新机会（图 3）。
2.2?检测Ca2+的荧光探针
Ca2+是细胞信号通路中重要的第二信使。它在许多细胞事件中发挥着关键作用，如受精、发育、学习和记忆，触发免疫、神经内分泌和神经元细胞的分泌过程[27，28]。因此，精确监测Ca2+的浓度，绘制Ca2+信号的时空图谱，进而探究其功能对于理解Ca2+的生物学功能至关重要。研究者已开发了多种成像材料，用于准确检测Ca2+的浓度和分布。
Roberts等[29]发展了一种具有选择性和细胞渗透性的Ca2+光声传感器（探针7）。探针以氨基部花菁为荧光和光声信号母体，以1，2?双（2?氨基苯氧基）乙烷?N，N，N'，N'?四乙酸（BAPTA）为Ca2+螯合基团，并引入乙酰氧基甲基酯，提高探针生物兼容性。探针7与Ca2+结合后，吸收光谱蓝移，基于光诱导电荷转移（PCT）机制，探针的光声信号明显降低，对Ca2+表现出特异性光声响应。通过荧光和光声成像技术，首次实现了对未经基因修饰的细胞和心脏器官以及斑马鱼幼虫的大脑中的Ca2+的实时成像（图 4）。
Mishra等[30]还设计了一种新型Ca2+近红外可逆光声探针（探针8），将Ca2+螯合剂APTRA连接到七甲基花菁染料上，实现Ca2+光声成像。基于探针8与Ca2+结合前后，光声信号的可逆变化，实现了对Ca2+的波动的光声成像。此外，探针8对Ca2+的亲和力是Mg2+的3倍，并可通过改变螯合部分和/或改变其在荧光团上的位置，进一步调节探针的选择性。由于探针8结构具有易修饰的特点，可作为平台构建一系列近红外金属荧光传感器，用于深层组织中二价阳离子的光声成像研究（图 4）。
Liu等[31]合成了一种比率检测Ca2+的纳米荧光探针（探针9）。探针结构中的两个甲醛基团为Ca2+配体（CaL），将CaL与聚乙烯亚胺（PEI）连接，利用席夫碱（Schiff base）合成了一种新的模板分子（PEI?CaL）。PEI?CaL不仅是Ca2+的特异性识别元件，而且是合成铜纳米团簇（CuNCs）的配体。他们以PEI?CaL为模板，在抗坏血酸（AA）存在下还原Cu2+，合成了CuNCs，将商业化荧光分子Alexa Fluor 660 （AF660）偶联到制备好的CuNCs表面，以此得到了比率检测Ca2+的纳米荧光探针。该探针的荧光强度与Ca2+浓度具有良好的线性关系，检测范围为2～350 μmol/L，检出限为（220±11） nmol/L。此外，探针9对Ca2+的响应时间小于2 s，稳定性好，选择性高。鉴于探针9具有低细胞毒性、良好的生物相容性和快速响应动力学的优势，可应用于神经元Ca2+的生物传感和成像。利用探针9，发现组胺诱导的神经元细胞质中Ca2+增加程度的异质性，神经元近端轴突Ca2+的增加与胞体相似，远端轴突Ca2+的变化小于胞体，而树突Ca2+浓度无明显变化。此外，他们还发现超氧阴离子诱导的神经元死亡可能是由于神经元Ca2+过载引起的，这为理解氧化应激相关疾病的机制提供了新的视角（图 5）。
基于二芳基乙烯的结构，Lv等[41]设计并合成了可特异性检测Aβ淀粉样蛋白的荧光探针（探针17）。在Aβ淀粉样蛋白的存在下，探针荧光强度显著增加，并伴有光谱蓝移现象。此外，该探针具有良好的光致变色性能，其荧光强度在紫外光和可见光的交替照射下可发生可逆变化，具有良好的抗疲劳性和抗光漂白性能。探针17可选择性地成像大脑切片中的Aβ沉积。探针结构中的DAE和ANCA部分对Aβ淀粉样蛋白疏水区域的结合作用，极大提高了探针的对Aβ的结合效率。基于探针17对Aβ淀粉样的高选择性识别，作者提出的该光控可变荧光成像策略为活体大脑高分辨成像提供了新思路（图 8）。
Li等[42]开发了3种基于电子供体?受体结构的新型近红外染料（探针18，a～c）。该探针可与Aβ淀粉样蛋白紧密结合，同时在近红外区域有明显的荧光增强。其中，烷基链长度适中的探针18b对Aβ淀粉样蛋白具有最高的结合力和选择性，同时探针具有较高稳定性，较好亲脂性，较低细胞毒性以及良好的血脑屏障通透性。对脑切片中的Aβ淀粉样蛋白进行荧光染色和对Tg小鼠进行活体近红外成像，结果表明探针18对Aβ淀粉样蛋白具有良好的捕获能力和清除能力，显示了探针18作为近红外探针在生物成像应用中的优势。这是首个兼具在体内对Aβ淀粉样蛋白的近红外成像和抑制Aβ淀粉样蛋白聚集的多功能染料。该设计策略将为开发具有良好的血脑屏障通透性和生物相容性的，更有效的Aβ成像工具开辟了一条新途径。该近红外染料探针18在AD的诊断和治疗领域具有广阔的应用前景（图 8）。
4?检测活性氧（ROS）的荧光探针
氧化损伤与多种脑部疾病的发生发展密切相关[43]。活性氧物种（ROS）多具有较强的氧化能力，可造成生物大分子的严重损伤[44]，加速细胞衰老及死亡，从而导致神经系统疾病的发生，探究活体脑部ROS浓度变化与脑部疾病的发生发展的关系，将有助于加深对脑部疾病的发生发展分子机制的理解。生物体内ROS氧化性强、寿命短、浓度低，所以，高选择性、高灵敏度、瞬时原位成像活体脑部的ROS一直是难题。近年来，研究者开发了多种荧光探针用于成像分析脑部的ROS的浓度变化。
Tang等[45]设计合成了一种新型的双光子荧光成像探针（探针19），用于脑部羟基自由基（·OH）的成像。探针19与·OH发生自由基加成反应，造成分子内电荷转移，导致探针19的荧光增强;探针19结构中的三氟甲基有助于分子穿过血脑屏障到达大脑，这是首个用于成像活体大脑中·OH的双光子荧光探针。活体小鼠大脑双光子成像结果表明，·OH的浓度在轻度与重度刺激导致的抑郁行为中有不同程度的明显上升。通过蛋白质质谱分析进一步发现·OH是通过氧化去乙酰化酶1（SIRT1），导致其失活，从而造成抑郁症的发生。该工作为阐明抑郁症的发生与发展的分子机制，为寻找治疗靶点及预后评价提供了新方法（图 9）。
基于臭氧（O3）与烯丁基中末端双键发生特异性的环加成反应，Li等[46]设计合成了一种用于检测小动物活体脑部O3的近红外荧光探针（探针20）。O3与探针20烯丁基中末端双键发生特异性的环加成反应，导致“前”七甲川花菁的共轭体系增大，发射出近红外荧光。探针具有特异性、高灵敏度、组织穿透性深等优点。作者利用探针20对小鼠脑部进行了成像分析，首次揭示了抑郁症小鼠脑内O3含量较正常小鼠有明显上升。他们还进一步揭示了抑郁小鼠脑部过量的O3导致产生过量的促炎症细胞因子IL8，进而诱导抑郁症的产生。该工作证明了O3的升高在抑郁症的发生发展过程中的重要作用，为在活体水平上探究抑郁症相关的分子机制提供了新方法（图 9）。
McQuade等[47]报道了一种基于Cu配合物的荧光探针（探针21），用于检测小鼠脑内NO的产生。作者将荧光团与Cu的配体相连，配体通过分子内光诱导的电子转移而淬灭荧光团荧光。探针与NO反应后导致金属的还原和/或配体的交换，从而荧光恢复。在模拟生理条件的缓冲液中，探针21对NO反应迅速且具有较好的选择性。探针21在细胞内被酯酶水解，生成带有负电荷、膜不渗透性的羧酸结构，极大地提高了探针在细胞内的驻留率。更重要的是，他们利用该探针成像发现了小鼠主嗅球组织切片上NO的产生。总之，该探针为更深入了解中枢神经系统NO信号的时空特性和生理调节机制提供了有力的成像工具（图10）。
5?检测神经递质及相关酶的荧光探针
大脑中的信号转导及多种神经功能包括学习、奖赏、注意力和运动控制等的发挥离不开神经递质的调控。大脑中神经递质的失调会导致精神疾病或神经退行性疾病，如多动症、精神分裂症、帕金森氏病等。而神经递质的失调与神经递质相关的合成酶和水解酶直接相关[48]。因此，为更好地研究神经递质及相关合成和水解酶在生理和病理过程中起到的作用，需要实时检测活体内神经递质及相关合成和水解酶变化。基于此，研究者发展了许多检测神经递质及相关酶的荧光探针。
Sun等[49]开发出了可基因编码的多巴胺探针（探针22）。该探针将对结构变化敏感的绿色荧光蛋白（cpEGFP）嵌入到人源多巴胺受体，当多巴胺受体结合多巴胺时，受体构象发生变化，从而cpEGFP的荧光发生变化，这就将多巴胺该化学信号转化为荧光信号。探针具有极高的分子特异性和时空分辨率，结合显微成像技术，可实现实时监测小鼠大脑内多巴胺浓度的动态变化情况。此外，该课题组还对探针进行了全方位的優化，发展出具有高/低亲和力的两种探针，适用于多巴胺释放量不同的脑区的成像。该研究策略为今后开发其它神经递质的荧光探针开辟了新思路（图11）。
基于相似的原理，Jing等[50]还首次成功开发了灵敏、特异、可遗传编码的乙酰胆碱荧光探针（探针23），通过对于神经递质特异的G蛋白偶联受体（GPCR）进行改造，嵌入对结构变化敏感的荧光蛋白，将受体在被神经递质激活后的构象变化转变为荧光蛋白荧光信号的变化，进而反映对应神经递质的浓度变化。通过对乙酰胆碱受体的改造，以及一系列突变筛选和优化，作者获得了对于乙酰胆碱具有灵敏光学响应的荧光探针，其对于生理浓度乙酰胆碱具有高信噪比的光学信号变化，并且具有较快的反应速度（亚秒级）以及良好的分子特异性，可对乙酰胆碱信号进行精确指征，并在不同生物体系中成功实现了内源乙酰胆碱信号的实时检测，为理解乙酰胆碱的神经生物学功能提供了重要工具（图12）。
乙酰胆碱酯酶（AChE）作为胆碱能系统中关键性的水解酶，直接决定了神經递质乙酰胆碱的代谢。Wang等[51]唐波课题组设计合成了一种高灵敏、高选择性、实时、原位检测活体脑部AChE活性的双光子荧光探针（探针24）。该探针具有响应迅速、高选择性、高灵敏度等优点，首次利用该探针进行双光子成像分析，发现了重度抑郁症小鼠脑内AChE活性显著高于正常小鼠。同时，借助双光子超氧阴离子自由基指示剂，首次观察到AChE水平的变化和超氧阴离子在抑郁症过程中呈正相关，说明氧化应激导致了AChE的过度激活，引发抑郁症。该研究为氧化应激调控AChE的活性在抑郁症病理学过程中发挥的作用提供了新策略与新途径。
Chao等[52]合成了两个近红外荧光探针， 探针25a和探针25b，并对其在不同组织中对AChE的检测进行了原位分析[52]。这两种探针对AChE均表现出较高的亲和力和选择性，IC50值在nmol/L水平。探针25b对AChE具有很高的选择性和灵敏度，也可应用于AChE浓度较低的大脑区域，如在纹状体区域进行成像。此外，作者还发现，当AChE受到有机磷等有毒分子的抑制时，探针25b的结合也会受到影响。该工作为在生物体内可视化检测乙酰胆碱酯酶的活性提供了一种新工具（图13）。
6?结论与展望
小分子、纳米、蛋白和化学发光探针等多种成像工具均可实现成像分析神经元及活体脑部的生物活性分子（包括金属离子，活性氧物种，神经递质及神经递质水解酶等）的变化，但各类探针在解决不同的科学问题时各有优势。小分子探针具有操作简便、生物相容性好的特点，更适用于原位、无损地检测神经元及活体脑部的生物活性分子的真实浓度，以及在病理状态下的浓度改变;而纳米探针具有易组装的特点，更适于构建具有多功能的成像工具，但由于血脑屏障的存在，活体成像受到限制;蛋白探针虽构建复杂，但可实现大脑不同部位的精准定位，更适于分析特定脑区的生物活性分子的浓度变化，从而深入分析其调控的神经功能。因此，应根据需要解决的问题和实际检测的环境，合理设计与应用成像工具。
尽管目前已经发展了多种用于神经元及活体大脑中成像生物活性分子的荧光成像工具，但是若要利用荧光成像方法进一步深入剖析生物活性分子调控大脑功能，揭示与疾病相关的分子机制，用于成像检测大脑中生物活性分子的荧光探针还应从以下几个方面进行发展：（1）更深组织成像。可借助多光子、光声等成像技术，发展具有组织穿透深度更深的探针，实现在生理或病理过程中活体原位示踪脑部的生物活性分子的变化。（2）精准定位成像。由于脑部的生物活性分子在大脑的功能与分布具有区域性，所以要发展多种精准定位不同脑区以及神经元亚细胞结构的荧光探针，借助超高分辨显微成像技术，深入探究相关生物活性分子在不同区域的调控作用，从而揭示与脑部疾病相关的分子机制。（3）多组分同时成像。在大脑中一个信号变化可能是多个生物活性分子协同作用的结果，因此要发展可实现同一位置、同时成像多个组分成像材料，探究在同一生理病理过程中多个生物活性分子的协同调控作用，进一步揭示与疾病相关的信号通路。（4）构建融合多种探针技术的成像工具。根据需要解决的问题，将多种类型探针技术融合。如结合蛋白的探针精准定位和小分子探针的高稳定性的特点，利用纳米探针易组装的优点，构筑出在细胞内集精准定位、多组分实时成像与治疗一体化的多功能成像工具。
总之，发展检测脑部生物活性分子的新型荧光探针仍将是荧光成像领域发展前沿的重要研究内容之一，这将为揭示脑部疾病发生与发展过程中活性分子的调控作用提供重要的新材料和新方法。
References
1?Raichle M E， MacLeod A M， Snyder A Z， Powers W J， Gusnard D A， Shulman G L. Proc. Natl. Acad. Sci. USA， 2001， 98（2）： 676-682
2?Vafadari B， Ahmad S， Leszek K， J. Neurochem.， ?2016， ?139： 91-114
3?Chang C J. Acc. Chem. Res.， ?2017， ?50（3）： 535-538
4?Chang C J. Nat. Chem. Biol.， ?2015， ?11（10）： 744-747
5?Wang K H， Penmatsa A， Gouaux E. Nature， ?2015， ?521（7552）： 322-327
6?Kavalali E T. Nat. Rev. Neurosci.， ?2015， ?16（1）： 5-16
7?Poewe W， Seppi K， Tanner C M， Halliday G M， Brundin P， Volkmann J， Lang A E. Nat. Rev. Dis. Primer.， ?2017， ?3：17013
8?Deas E， Cremades N， Angelova P R， Ludtmann M H， Yao Z， Chen S， Gissen P. Antioxid. Redox Sign.， ?2016， ?24（7）： 376-391
9?Yohn C N， Gergues M M， Samuels B A. Mol. Brain， ?2017， ?10（1）： 28-40
10?Campion D， Pottier C， Nicolas G， Le G K， Rovelet?Lecrux A. Mol. Psythiatry， ?2016， ?21（7）： 861-871
11?Schenk D， Barbour R， Dunn W， Gordon G， Grajeda H， Guido T， Kholodenko D. Nature， ?1999， ?400（6740）： 173-177
12?Othman A E， Afat S， Brockmann M A， Nikoubashman O， Brockmann C， Nikolaou K， Wiesmann M. J. Neuroradiol.， ?2016， ?43（1）： 1-5
13?Schlemmer H P W， Pichler B J， Schmand M， Burbar Z， Michel C， Ladebeck R， Heiss W D. Radiology， ?2008， ?248（3）： 1028-1035
14?Pereira S， Pinto A， Alves V， Silva C A. IEEE. T. Med. Imaging， ?2016， ?35（5）： 1240-1251.
15?Owens E A， Henary M， El Fakhri G， Choi H S. Acc. Chem. Res.， ?2016， ?49（9）： 1731-1740
16?Cao D， Liu Z， Verwilst P， Koo S， Jangjili P， Kim J S， Lin W. Chem. Rev.， ?2019， ??DOI： 1021/acs.chemrev.9b00145
17?Hong G， Diao S， Chang J， Antaris A L， Chen C， Zhang B， Kuo C J. Nat. Photonics， ?2014， ?（9）：723-730
18?Qian X， Xu Z. Chem. Soc. Rev.， ?2015， ?（14）： 4487-4493
19?Shen C， New E J. Metallomics， ?2015， ?7（1）： 56-65
20?Chen Y， Bai Y， Han Z， He W， Guo Z. Chem. Soc. Rev.， ?2015， ?44（14）： 4517-4546
21?Li W， Fang B， Jin M， Tian Y. Anal. Chem.， ?2017， ?89（4）： 2553-2560
22?Zhu H， Fan J， Zhang S， Cao J， Song K， Ge D， Dong H， Wang J， Peng X. Biomater. Sci.， ?2014， ?2（1）： 89-97
23?Lee H J， Cho C W， Seo H， Singha S， Jun Y W， Lee K H， Jung Y， Kim K T， Park S， Bae S C， Ahn K H. ?Chem. Commun.， ?2016， ?52 （1）： 124-127
24?Khan M， Goldsmith C R， Huang Z， Georgiou J， Luyben T T， Roder J C， Lippard S J， Okamoto K. Proc. Natl. Acad. Sci. USA， ?2014， ?111（18）： 6786-6791
25?Bourassa D， Elitt C M， McCallum A M， Sumalekshmy S， McRae R L， Morgan M T， Siegel N， Perry J W， Rosenberg P A， Fahrni C J. ACS Sens.， ?2018， ?3 （2）： 458-467
26?Peng J， Xu W， Teoh C L， Han S， Kim B， Samanta A， Er J C， Wang L， Yuan L， Liu X， Chang Y T. J. Am. Chem. Soc.， ?2015， ?137（6）： 2336-2342
27?ltes T， Kirizs T， Nusser Z， Holderith N. J. Neuroradiol.， ?2017， ?37（7）： 1910-1924
28?Weisenburger S， Tejera F， Demas J， Chen B， Manley J， Sparks F T， Vaziri A. Cell， ?2019， ?177（4）： 1050-1066
29?Roberts S， Seeger M， Jiang Y， Mishra A， Sigmund F， Stelzl A， Lauri A， Symvoulidis P， Rolbieski H， Preller M， Dean Ben X L， Razansky D， Orschmann T， Desbordes S， Vetschera C P， Bach T， Ntziachristos V， Westmeyer G G. J. Am. Chem. Soc.， ?2018， ?140（8）： 2718-2721
30?Mishra A， Jiang Y， Roberts S， Ntziachristos V， Westmeyer G G. Anal. Chem.， ??2016， ?88（22）： 10785-10789
31?Liu Z， Jing X， Zhang S， Tian Y. ?Anal. Chem.， ?2019， ?91（3）： 2488-2497
32?Narayanaswamy N， Chakraborty K， Saminathan A， Zeichner E， Leung K， Devany J， Krishnan Y. Nat. Methods， ?2019， ?16（1）： 95-102
33?Cotruvo J A， Aron A T， Ramos?Torres K M， Chang C J. Chem. Soc. Rev.， ?2015， ?44（13）： 4400-4414
34?Xiao T C， Ackerman M， Carroll E C， Jia S， Hoagland A， Chan J， Thai B， Liu C S， Isacoff E Y， Chang C J . Nat. Chem. Biol.， ?2018， ?14（7）： 655-663
35?Dodani S C， Firl A， Chan J， Nam C I， Aron A T， Onak C S， Ramos?Torres K M， Paek J， Webster C M， Feller M B， Chang C J. Proc. Natl. Acad. Sci. USA， ?2014， ?111： 16280-16285
36?Campion D， Pottier C， Nicolas G， LeGuennec K， Rovelet?Lecrux A. Mol. Psychiatry， ?2016， ?21（7）： 861-871
37?Zhang X， Tian Y， Zhang C， Tian X， Ross A W， Moir R D， Sun H， Tanzi R E， Moore A， Ran C. Proc. Natl. Acad. Sci. USA， ?2015， ?112（31）： 9734-9739
38?Kim D， Moon H， Baik S H， Singha S， Jun Y W， Wang T， Kim K H， Park B S， Jung J， Mook?Jung I， Ahn K H. J. Am. Chem. Soc.， ?2015， ?137（21）： 6781-6789
39?Cui M， Ono M， Watanabe H， Kimura Liu H B， Saji H. J. Am. Chem. Soc.， ?2014， ?136（9）： 3388-3394
40?Watanabe H， Ono M， Saji H. Chem. Commun.， ?2015， ?51（96）： 17124-17127
41?Lv G， Cui B， Lan H， Wen Y， Sun A， Yi T. Chem. Commun.， ?2015， ?51（1）： 125-128
42?Li Y， Xu D， Ho S L， Li H W， Yang R， Wong M S. Biomaterials， ?2016， ?94： 84-92
43?Ma M W， Wang J， Zhang Q， Wang R， Dhandapani K M， Vadlamudi R K， Brann D W. ?Mol. Neurodegeneration， ?2017， ?12（1）： 7
44?Wang Y， Branicky R， No A， Hekimi S. ?J. Cell Biol.， ?2018， ?217（6）： 1915-1928
45?Wang X， Li P， Ding Q， Wu C， Zhang W， Tang B. ?Angew. Chem. Int. Ed.， ??2019， ?58（14）： 4674-4678
46?Li P， Wang J， Wang X， Ding Q， Bai X， Zhang Y， Su D， Zhang W， Zhang W， Tang B. ?Chem. Sci.， ??2019， ?10（9）： 2805-2810
47?Mc Quade L E， Ma J， Lowe G， Ghatpande A， Gelperin A， Lippard S J. ?Proc. Natl. Acad. Sci. USA， ?2010， ?107（19）： 8525-8530
48?Allen J A， Halverson?Tamboli R A， Rasenick M M. ?Nat. Rev. Neurosci.， ?2007， ?8（2）： 128
49?Sun F， Zeng J， Jing M， Zhou J， Feng J， Owen S F， Luo Y， Li F， Wang H， Yamaguchi T， Yong Z， Gao Y， Peng W， Wang L， Zhang S， Du J， Lin D， Xu M， Kreitzer A C， Cui G， Li Y L. ?Cell， ?2018， ?174（2）： 481-496
50?Jing M， Zhang P， Wang G， Feng J， Mesik L， Zeng J， Jiang H， Wang S， Looby J C， Guagliardo N A， Langma L W， Lu J， Zuo Y， Talmage D A， Role L W， Barrett P Q， Zhang L I， Luo M， Song Y， Zhu J J， Li Y L. ?Nat. Biotechnol.， ?2018， ?36（8）： 726-737
51?Wang X， Li P， Ding Q， Wu C， Zhang W， Tang B. ?J. Am. Chem. Soc.， ?2019， ?141（5）： 2061-2068
52?Chao S， Krejci E， Bernard V， Leroy J， Jean L， Renard P Y. ?Chem. Commun.， ?2016， ?52 （77）： 11599-11602
Recent Advances in Fluorescence Imaging
of Bioactive Molecules in Neurons and in Vivo
WANG Xin， LI Ping*， ZHANG Wen， TANG Bo*
（Key Laboratory of Molecular and Nano Probes， Ministry of Education; College of Chemistry，
Chemical Engineering and Materials Science， Shandong Normal University， Jinan 250014， China）
Abstract?Brain possesses a unique chemical composition and reactivity. Bioactive molecules in brains including metal ions， reactive oxygen species， neurotransmitters and neurotransmitter hydrolases play multifarious and pivotal roles in the function of brain. These molecules keep steady?state concentrations for maintaining the structure and function of brain. However， the abnormal changes at bioactive molecular levels are associated with various brain diseases such as Parkinson's disease， Alzheimer's disease， depression， and so on. Therefore， to explore the concentration and regulation of those molecules in brains is particularly essential for revealing the mysteries of brains and understanding the occurrence and development of brain diseases. Fluorescence imaging is a powerful tool to track bioactive molecules in neurons and in brain because of its remarkable advantages， such as high temporal?spatial resolution， excellent biocompatibility and high sensitivity. In recent years， with the development of fluorescence imaging technology， a variety of fluorescent probes for brain and neurons imaging have been reported. In this review， we summarized the progress of molecular probes， nanoprobes and protein probes for detection of bioactive molecules in neurons and in brain. Furthermore， future research for fluorescence imaging was prospected.
Keywords?Fluorescent probe; Brain imaging; Bioactive molecule; Review
