诱导脂肪干细胞成软骨分化的研究进展

    赖仲宏 钟佳宁 徐房添

    【关键词】 脂肪干细胞;生长因子;成软骨分化;软骨缺损;组织工程

    中图分类号：R68 ? 文献标志码：A ? DOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2020.10.012

    由于创伤、肿瘤、骨关节炎等原因常导致软骨组织缺损，软骨组织缺损是骨科领域最具挑战性的难题之一[1]。软骨组织由于缺乏营养血管、神经和淋巴回流，常导致软骨自我修复能力差、增殖活性和再生能力低[2]。近年来，软骨组织工程的发展为软骨组织缺损修复提供了新的思路，软骨组织工程主要包括三方面：种子细胞、生长因子、生物支架[3]。脂肪干细胞（Adipose-derived stem cells，ADSCs）作为理想的种子细胞具有组织来源丰富、取材容易、免疫原性低、增殖速度快和具有多向分化潜能等优点，已成为软骨组织工程研究的热点。ADSCs在不同的诱导条件下可向脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞等方向分化[4]。基于ADSCs具有成软骨分化特性，软骨组织工程为软骨缺损修复提供了新的治疗方法。本文将从脂肪干细胞的特性、ADSCs成软骨分化的主要影响因素和当前现状及展望等方面进行综述。

    1 脂肪干细胞的起源和特点

    ADSCs起源于细胞的中胚层，是一种具有多向分化潜能的间充质干细胞。2001年，ZUK等[5]从脂肪组织中分离出成纤维母样细胞，并发现在不同的诱导条件下可向脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞等方向分化。在后续的研究中，通过对 PLA的克隆形成能力研究和多谱系分化能力的鉴定，发现PLA具有干细胞的特性，并首次将分离的细胞命名为ADSCs。ADSCs与骨髓间充质干细胞（bone marrow stem cells，BMSCs）同属于间充质干细胞，生物学特性基本相似，在分子表型上，都能够阳性表达CD29、CD44、CD90及CD105，阴性表达CD31、CD45、HLA-DR，同时2种细胞都能阳性表达Nanog、Oct-4、SOX-2等干细胞相关转录因子[6]。ADSCs除了具有间充质干细胞的共性外，还具有以下优势：脂肪组织来源丰富、取材方便还具有免疫抑制作用。因此，ADSCs作为种子细胞已成为软骨组织工程的研究热点。

    2 ADSCs诱导成软骨分化

    脂肪干细胞作为组织工程中常用的种子细胞，在不同的诱导环境下可向脂肪细胞、骨细胞、软骨细胞、神经细胞等方向分化。目前，有学者提出诱导ADSC成软骨细胞分化的方式主要有5种：生长因子、基因修饰、共培养体系、生长因子与共培养结合、生物支架材料[7]。

    2.1 外源性生长因子

    2.1.1 转化生长因子-β（TGF-β） TGF-β是一组多功能蛋白质，它能影响各种细胞的生长、增殖、分化、凋亡以及免疫调节等功能。TGF-β家族包含TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3，TGF-β被认为是诱导ADSCs成软骨分化最重要的生长因子之一。TGF-β主要和TGF-β受体结合即激活素受体激酶-5（ALK-5）磷酸化，进而激活Smad通路，启动软骨特异性基因的转录，促进软骨细胞产生Ⅱ型胶原（COL-Ⅱ）及软骨聚集蛋白聚糖（GAGS）表达，最终促进ADSC成软骨分化[8]。王洪林等[9]使用脂质体介导法把TGF-β1成功转染ADSCs，转染后成软骨分化的特异性软骨细胞外基质表达增多，进一步了证实了转染TGF-β1可以促进ADSCs向成软骨细胞方向分化。TGF-β2作为TGF-β家族成员，在多种细胞的生长和分化过程中都起重要作用，TGF-β2可以诱导间充质干细胞转化为软骨细胞，促进软骨细胞的生长、增殖、分化和细胞外基质合成[10]。有学者提出联合使用10 ng/mL TGF-β3和10 ng/mL BMP-6是诱导ADSCs成软骨分化的“黄金搭档”，与单独使用TGF-β3相比，更能有效地增强ADSCs成软骨分化潜能[11]。但是，也有学者提出TGF-β1和TGF-β3的诱导效应并无明显差异[12～13]。TGF-β已經被证实可以有效地诱导ADSCs成软骨分化形成，但其刺激ADSCs成软骨分化的分子生物学机制还有待进一步研究。

    2.1.2 骨形态发生蛋白（BMP） BMP是一组结构相似、高度保守的功能蛋白，可以刺激DNA合成和细胞复制，从而促进间充质干细胞向骨细胞和软骨细胞定向分化。目前，BMP被认为是ADSCs成软骨分化的另一个重要生长因子。当前研究表明，在BMP家族成员中，BMP-2、4、7、9、14在ADSCs成软骨分化中发挥重要作用[14]。有学者发现，在软骨细胞中添加外源性BMP-2可以刺激Ⅱ型胶原的表达和合成，从而促进软骨细胞表型的扩展[15]。也有学者提出单独应用BMP-2诱导作用并不明显，诱导的软骨容易发展为肥大[5]。HOBEN等[16]认为BMP-4仅增加了细胞的增殖和刺激胶原的产生。BMP-7对间充质干细胞产生趋化作用，并促进其向软骨细胞分化，同时能够促进软骨细胞分泌产生软骨特异性的细胞外基质（蛋白多糖和Ⅱ型胶原）[17]。BMP-9也称生长分化因子2（GDF-2），在胎儿发育过程中主要在中枢神经系统和肝脏中表达，但在成人中主要表达于肝脏。BMP-9和BMP-2在促进间充质干细胞成软骨分化过程中比较相似，有数据[14]表明BMP-9在诱导软骨分化方面比BMP-2的效力高50～200倍。BMP-9是一种有效的体外软骨细胞增殖分化的调节剂，相信在往后的研究中会受到更多的关注。

    BMP-14又称软骨衍生蛋白1或GDF-5，被认为是目前诱导ADSCs成软骨分化过程中最强的生长因子之一，在早期软骨形成以及在后面多个阶段中都发挥着重要作用。同时，GDF-5能够促进ACAN表达，又能够抑制COL X表达。通过GDF-5目的基因真核表达质粒pcDNA3.1（+）/GDF-5转染入鼠ADSC，能显著增加Ⅱ型胶原、软骨蛋白聚糖（GAGS）的表达，诱导ADSCs成软骨细胞方向分化。ADSCs经GDF-5诱导后，发现蛋白聚糖合成能力增强，可促进细胞基质内GAGS合成增多，有利于ADSCs向软骨方向分化。此外，BMP-6也在ADSC成软骨分化的过程中发挥重要作用。在三维培养环境中，高浓度的BMP-6可以促进软骨特异性成分COL2A1及AGC1表达，同时，还能抑制肥大软骨细胞标志物COL10A1表达[18]。总之，BMP家族在软骨修复治疗策略中的应用已被广泛研究，并且取得了一些突破性的进展。然而，在将这些研究转化为治疗软骨损伤和骨关节炎的新疗法之前，仍有许多问题需要研究。

    2.1.3 胰岛素样生长因子1（IGF-1） IGF-1是一组能够促进生长的多肽类物质，被认为是诱导软骨形成、调节细胞生长代谢最关键的细胞因子之一。IGF-1可以增强软骨细胞中COL Ⅱ和ACAN的表达，并且能够促进软骨细胞SOX9的表达，形成COL2A1;同时，通过抑制蛋白酶的生成和释放来减少ACAN的降解[19]。ZHOU等[20]研究证实IGF-1具有单独诱导ADSCs成软骨细胞分化的潜能，并在体内外与TGF-β1共同作用诱导成软骨细胞分化。

    2.1.4 碱性成纤维细胞生长因子（FGF） FGF是一组可以促进细胞有丝分裂的重要因子，在胚胎发育中参与细胞的增殖、分化和迁移等活动。NASRABADI等[21]研究发现FGF2降低了ALP和COL X的表达，以及通常在TGFβ/BMP中增加的促软骨标志物，促进成软骨分化。然而，也有学者提出与生长因子联合诱导过程中FGF-2抑制了BMP-6诱导成软骨分化的能力[22]。目前对FGF-2诱导软骨形成方面尚存在争议，还需要进一步的研究。

    2.2 基因修饰 又称基因工程（Genetic engineering），是将软骨生长因子的基因通过载体转入靶细胞内或者将携带软骨生长因子的载体附着于生物支架上，使其能够适时、稳定、持续地表达，促使脂肪干细胞向软骨细胞方向增殖、分化[23]。阮世强等[24]通过聚乳酸/聚羟基乙酸共聚物支架复合BMP-2基因转染ADSCs，发现显著促进透明软骨的形成和软骨组织的修复。马洪斌等[25]用腺病毒携带BMP-14基因成功转染ADSCs，发现修复软骨缺损的能力得到大幅提升。目前，基因工程作为软骨损失修复的一种新途径，是以后软骨组织工程研究的新趋势。

    2.3 共培养 是一组诱导一种细胞向另一种细胞增殖分化和调控的培养体系。通过ADSCs和软骨细胞共培养的生物诱导模式，能够诱导ADSCs向软骨细胞方向分化。SHI等[26]使用ADSCs和软骨细胞共培养，证实了在共培养体系下的关节软骨细胞增殖分化，并且发现可以抑制软骨细胞的凋亡，从而促进ADSCs向成骨和成软骨方向分化。也有学者通过ADSCs替代一半的软骨细胞共培养，发现可以获得相似的ECM和COL Ⅱ的表达，同时降低了COL Ⅰ、COL X和TNF-α的表达，表现出相似的新生软骨形成能力[27]。共培养体系可以促进ADSCs向软骨细胞分化，并且有助于改善新生软骨的凋亡、肥大和纤维化等问题。

    2.4 生长因子与共培养联合 生长因子与共培养联合也是近年来比较常用的培养方法。有学者利用HADSCs和TGF-β3共培养，发现人耳软骨细胞和生长因子在诱导HADSCs成软骨分化、提高细胞活力、上调成软骨基因表达等方面具有积极的作用[28]。袁虹等人[29]用BMP-14成功轉染ADSCs后与软骨细胞共培养，实验证实生长因子与共培养联合能诱导并促进兔ADSCs向软骨细胞分化，同时两者之间还具有协同作用。

    2.5 支架材料 近年来随着科技的发展，生物支架材料已成为软骨组织工程研究的热点。生物支架材料主要包括人工合成的高分子材料和天然来源的生物大分子蛋白[30]。GRIFFIN等[31]使用氩气等离子体修饰纳米复合聚氨酯支架，发现可提供适当的表面线索，以增强ADSC向骨和软骨的方向分化。合适的生物支架材料能够在软骨组织工程中发挥积极作用，如何构建一种合适的支架材料，仍是目前软骨组织工程的难点。

    3 其他影响脂肪干细胞成软骨分化因素

    在诱导ADSCs成软骨分化的过程中，还受到诸多因素的影响，如供体的年龄、取材部位、低氧、细胞代数、细胞数量等[32]。年龄对ADSCs诱导成软骨分化能力的影响尚有争议，大部分学者认为ADSCs成软骨分化的能力随着年龄的增加而下降[33～34]，然而也有部分学者认为年龄对人脂肪干细胞成软骨分化的能力影响不大[35]。目前，大多数研究的首选部位是皮下脂肪，如大网膜、腹部和臀部等[36～37]，不同部位取得的脂肪干细胞对成软骨分化也有差异。在低氧条件下可以诱导因子稳定表达，促进软骨相关基因表达，抑制YAP表达的同时不影响HIF-1α信号通路的表达，但会抑制由低氧引起的SOX9表达的上调。HIF-1α/YAP信号轴可能在促进软骨细胞分化和维持软骨细胞的表型中起重要作用[38]。文献报道体外传代数在2～5代之间比较合适，此时细胞增殖、分化能力较强[39～41]。也有学者研究发现不同的细胞浓度也会影响ADSCs成软骨分化，体外及动物实验均表明ADSCs复合在高浓度诱导的细胞支架上成软骨分化的效果较好[42]。此外，诱导脂肪干细胞成软骨分化的过程中可能还受生物力学、动态环境和电磁场刺激等因素的影响。

    4 展望

    脂肪干细胞作为软骨组织工程中理想的种子细胞，在软骨组织工程研究及应用方面前景广阔。ADSCs在成软骨分化治疗软骨缺损方面取得了初步进展，但目前还处于动物试验阶段，少数已进入临床阶段。诱导脂肪干细胞成软骨分化的条件有很多，其中生长因子复合生物支架是目前研究的新趋势。当前ADSCs成软骨分化的实验研究都还存在许多挑战，比如：（1）ADSCs成软骨分化过程中细胞生长因子是如何调控的分子机制还有待进一步研究。（2）如何将种子细胞、生长因子、生物支架三者完美结合，形成最优分化条件。（3）诱导ADSCs成软骨分化的临床安全性、致瘤性以及对同种异体移植的免疫反应等问题还有待进一步的研究。相信随着软骨组织工程和其他学科的发展，诱导脂肪干细胞成软骨分化能为软骨组织缺损的治疗提供新的希望。

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    （收稿日期：2020-05-21 修回日期：2020-09-28）

    （编辑：潘明志）