超高效液相色谱法测定黄芪降压方提取液中黄芪甲苷、柚皮苷两种活性成分的含量

    张松涛 孙宾娟 马洁

    

    

    

    【摘要】 目的 研究超高效液相色谱（UPLC）法在测定黄芪降压方提取液中黄芪甲苷、柚皮苷两种活性成分的含量。方法 利用UPLC对黄芪降压方的提取药液进行分析，流动相用乙腈-去离子水测定，色谱柱运用Agilent SB C18柱来测定，ESI离子源的检测离子对分别是829/783及579/271，以此实施UPLC测定，分析UPLC的应用价值。结果 黄芪甲苷、柚皮苷线性关系较好（r>0.999）;黄芪甲苷平均回收率为100.34%，RSD值为1.89%;柚皮苷平均回收率为101.02%，RSD值为1.74%;连续6次测定，黄芪甲苷RSD值为1.36%，柚皮苷为1.43%;不同人员进行检测，黄芪甲苷RSD值为1.80%，柚皮苷为2.27%，不同时间测定，黄芪甲苷RSD值为2.55%，柚皮苷为1.91%;24 h内黄芪甲苷的RSD值为1.85%，柚皮苷的为2.97%。结论 UPLC对于黄芪降压方中黄芪甲苷、柚皮苷检测具有较高准确性和精密度，可为临床评价治疗效果质量提供参考数据。

    【关键词】 超高效液相色谱法;黄芪降压方;柚皮苷;黄芪甲苷

    中图分类号：R927.2 ? 文献标志码：A ? DOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2020.10.011

    【Abstract】 Objective To study the content of astragaloside IV and naringin in the extract of Astragalus hypotension prescription tested by ultra high performance liquid chromatography （UPLC）. Methods The extracted liquid of Astragalus hypotensive prescription was analyzed by UPLC， the mobile phase was tested by acetonitrile-deionized water， the chromatographic column was tested by Agilent SB C18. The detection ion pair of ESI ion source was 829/783 and 579/271， respectively， they were tested by UPLC to analyze the application value of UPLC. Results The linear relationship between astragaloside IV and naringin was good （r > 0.999）. The average recovery rate of astragaloside IV was 100.34% and RSD value was 1.89%. The average recovery rate of naringin was 101.02% and RSD value was 1.74%. 6 consecutive tests showed that the RSD value of astragaloside IV and naringin were 1.36% and 1.43%， respectively. Tests by different persons showed that the RSD value of astragaloside IV and naringin were 1.80% and 2.27%， respectively. Tests in different times point showed that the RSD value of astragaloside IV and naringin were 2.55% and 1.91%， respectively. Within 24 h， the RSD value of astragaloside IV and naringin were 1.85% and 2.97%， respectively. Conclusion UPLC has high accuracy and precision in detecting astragaloside IV and naringin in Astragalus hypotensive prescription， which can provide reference data for clinical evaluation of therapeutic effect quality.

    【Key words】 UPLC;Astragalus hypotensive prescription;naringin;astragaloside IV

    黃芪降压方组方成分为茯苓、化橘红、黄芪等多种药材，具有祛湿逐瘀、通络活血以及降压降脂效果，而化橘红和黄芪属于君药，其中黄芪性味温甘，可利水消肿、益气固表，现代药理研究证实其具有降血压以及提高免疫力的效果;化橘红性温味辛、苦，可化痰止咳，现代药理研究证实其具有降血脂效果。两者联合应用具有较高的软化血管以及降血压的作用[1～3]。截止到目前，有关黄芪降压方中的黄芪、化橘红化学成分和质量控制的研究主要采用指纹图谱法，无法实现对全方中的主要活性成分进行同时检测[4～5]。本研究采用超高效液相色谱（ultra performance liquid chromatography，UPLC）法对黄芪降压方提取液中柚皮苷、黄芪甲苷成分含量进行测定，报告如下。

    1 材料与方法1.1 仪器材料 高效液相色谱仪-质谱联用仪（Accela型号自动进样器和高压泵、ESI离子源、三重四级杆）;美国Agilent公司的Agilent SB C18柱（2.7 μm，2.1×100 mm）;XS205DU型号的电子分析天平;低温高速的离心机;恒温数控的超声波清洗器;涡旋混合仪;氮气干燥剂;批号为110844-201109、纯度为98%的柚皮苷、黄芪甲苷的对照品;UPLC法所用的分析试剂均属于色谱纯;药材提取的所用试剂均属于分析纯。

    1.2 方法

    1.2.1 制备对照品溶剂 取适量柚皮苷、黄芪甲苷的对照品于10 mL的量瓶内，利用甲醇予以溶解、稀释到刻度，获取各化学物的含量为10 μg·mL-1对照品混合剂。

    1.2.2 制备供试品溶剂 取黄芪降压方药材，加500 mL水煎煮2次，每次1 h，合并水煎液，再次加热使其浓缩到100 mL，过滤;取1 mL滤液，添加甲醇予以逐级稀释到原浓度1000倍得供试品溶剂。

    1.3 UPLC法条件 通过ESI离子源进行质谱分析，于正负离子模式下予以同时扫描，负离子喷雾电压3000 V，离子传输管的温度300℃，汽化室温度350℃，管径补偿电压为100 V，辅气压力为10 psi，鞘气压力为30 psi，通过选择反应监测模式（select reaction monitoring，SRM）进行扫描，黄芪甲苷的检测离子对是829/783，其碰撞电压是20 V;柚皮苷的检测离子对是579/271，其碰撞电压是29 V。通过等度洗脱方式进行UPLC分离，流动相利用60∶40、v/v的乙腈-去离子水溶液，洗脱时间是4 min，柱温为25℃，流速为300 μL·min-1，进样量是10 μL。

    1.4 方法学

    1.4.1 标准曲线以及线性 取适量对照品混合剂于10 mL量瓶内，加甲醇稀释达刻度，可获得20 ng·mL-1、50 ng·mL-1、100 ng·mL-1、200 ng·mL-1、500 ng·mL-1、1000 ng·mL-1的不同濃度溶剂，取上述溶剂依据“1.3”中方法实施UPLC分析，后记录总离子流图，其中横坐标X为各个分子离子峰的峰面积，纵坐标为浓度，实施线性回归。结果显示方法线性良好（r黄=0.9991，r柚=0.9995）可于20～1000 ng·mL-1范围内对于相关的化合物予以准确定量。

    1.4.2 测试图谱 于室温下，对黄芪甲苷、黄芪甲苷对照品、柚皮苷以及柚皮苷对照品进样后予以17 min色谱图，分别为图1、图2。

    1.4.3 准确度、精密度 通过提取回收率方式对准确度予以测定，其步骤为：取5 mL供试品溶剂于10 mL量瓶内，加适量柚皮苷、黄芪甲苷的对照品，加甲醇定容到刻度获取标准添加剂;取标准添加剂依据“1.3”步骤予以连续UPLC分析，对每份样品进行2次测定，记录峰面积，对回收率以及RSD值进行计算。

    1.4.4 中间精密度 取同一份供试品溶剂，由3名不同的人员，于1 d内依据“1.3”的方式进行UPLC分析3次，另由同一名实验人员连续3 d依据“1.3”方式测定，每天3次，对峰面积进行记录，并计算RSD值。

    1.4.5 稳定性考察 取同一份供试品溶剂于自动进样器内，分别在2 h、4 h、6 h、8 h、12 h、24 h依据“1.3”中方式连续实施UPLC分析，并记录峰面积，进行RSD值计算。

    1.5 测定黄芪降压方不同批次的药材活性 取黄芪降压方药材10份，依据“1.2”中方法制作供试品溶剂，依据“1.3”中方法对含量进行测定，经峰面积进行记录，并对各组含量进行测定。

    2 结 ?果2.1 准确度、精密度 黄芪甲苷平均回收率为100.34%，RSD值为1.89%，柚皮苷平均回收率为101.02%，RSD值为1.74%。见表1、表2。连续测定6次，黄芪甲苷RSD值为1.36%，柚皮苷为1.43%。

    2.2 中间精密度 不同人员进行检测，黄芪甲苷RSD值为1.80%，柚皮苷为2.27%;不同时间测定，黄芪甲苷RSD值为2.55%，柚皮苷为1.91%。

    2.3 稳定性考察 24 h内的黄芪甲苷的RSD值为1.85%，柚皮苷为2.97%。

    2.4 黄芪降压方不同批次的药材活性 黄芪甲苷的含量平均为0.1383 mg·mL-1，RSD值为9.82%，而柚皮苷的平均含量是0.3391 mg·mL-1，RSD值是4.16%。见表3。

    3 讨 ?论 ?黄芪甲苷的含量检测属于黄芪制剂主要质量检测指标，早期以薄层扫描的检测方式为主，其操作繁琐，且重现性较差，加上黄芪甲苷对于紫外末端具有吸收效果，致使紫外检测法的灵敏度较低，且杂质干扰效果明显，进一步降低敏感性[6]。故需寻找更为适合的检测方式。在黄芪降压方中主要成分为黄芪及化橘红，而临床常用蒸发光散射计测器测定对于黄芪甲苷较为敏感，但对于化橘红的主要活性物质敏感性较差，无法准确测量其含量。因此仍需寻找更为有效测定方式，可对多个主要活性成分的含量进行同时测定。

    UPLC属于分离科学中全新类别，其基于高效液相色谱原理以及理论，并包括极低系统体积、小颗粒填料和快速检测手段等一种全新技术，可提高分析灵敏度、色谱峰的容量以及通量[7]。UPLC的Agilent SB C18柱的粒径为2.7 μm，有助于分离物质，进而提高准确性、精密度，利用自动进样器可有效降低交叉污染发生率、扩散率，进一步确保测定含量的准确性，加之其准确度上升，缩短分析时间，减少检测溶剂量，降低测定成本[8]。本研究结果发现，黄芪甲苷、柚皮苷的线性关系比较好（r>0.999），说明线性范围较宽;而黄芪甲苷平均回收率为100.34%，RSD值为1.89%，柚皮苷平均回收率为101.02%，RSD值为1.74%，说明UPLC的准确度较高，并经连续测定6次显示，黄芪甲苷RSD值为1.36%，柚皮苷为1.43%，代表UPLC的精密度较高，且不同人员检测结果显示为黄芪甲苷RSD值为1.80%，柚皮苷为2.27%，不同时间测定结果显示为黄芪甲苷RSD值为2.55%，说明方法的中间精密度较高。此外，24 h内黄芪甲苷的RSD值为1.85%，柚皮苷的为2.97%，说明黄芪降压方的活性物质在24 h内的稳定性较高，另外本研究10份样品中，黄芪甲苷的含量平均为0.1383 mg·mL-1，RSD值为9.82%，而柚皮苷的平均含量是0.3391 mg·mL-1，RSD值是4.16%，可知UPLC法具有简便快捷，准确性、精密度、稳定性均较高的特点。

    综上所述，利用UPLC法测定黄芪降压方提取液中黄芪甲苷、柚皮苷两种活性成分含量，具有快捷简便以及准确性、精密度、稳定性高特点，且可为临床提高治疗效果质量提供可靠数据。

    参 考 文 献

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    [2] ?姜辉，高家荣，张家富，等.超高效液相色谱-蒸发光散射法测定新风胶囊中黄芪甲苷的含量[J].安徽中医学院学报，2013，32（5）：75-77.

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    [4] ?常馨予，郭桂明，范峥，等.UPLC-MS/MS法测定黄芪桂枝五物汤在大鼠血浆中两种活性成分及药代动力学研究[J].中国药学（英文版），2018，27（4）：263-272.

    [5] ?王亚丽，田曼，王昌利，等.高效液相色谱法检测不同施肥栽培黄芪的毛蕊异黄酮葡萄糖苷及黄芪甲苷含量[J].安徽医药，2019，23（10）：1943-1947.

    [6] ?熊德庆.LC-MS测定黄芪桂枝五物汤中3种活性成分的含量[J].贵州医药，2018，42（11）：1396-1397.

    [7] ?HOU Y，CHEN H，LI X，et al.A modified QuEChERS method for determination of pyrethroid residues in traditional Chinese medicine oral liquids by high-performance liquid chromatography[J].Molecules，2019，24（8）：1470.

    [8] ?REITZNEROVA A，SULEKOVA M，NAGY J，et al.Lipid peroxidation process in meat and meat products：a comparison study of malondialdehyde determination between modified 2-thiobarbituric acid spectrophotometric method and reverse-phase high-performance liquid chromatography[J].Molecules，2017，22（11）：1988.

    （收稿日期：2020-03-19 修回日期：2020-06-23）

    （編辑：潘明志）