金黄色葡萄球菌候选特征肽的靶向分析

    赵宏 王玉迎 赵良娟 宓捷波 赵化冰 张峰 冯峰 曾静 王洪彬 董志珍

    

    

    

    摘要采用液相色谱串联质谱联用的靶向分析技术，通过检测食源性致病菌金黄色葡萄球菌水解生成的特征肽，实现食品中致病菌的高效检测。针对文献报道的金黄色葡萄球菌的9种候选特征肽，验证了这些特征肽的靶向分析方法，考察和比较了分析效能。结果表明，基于多反应监测模式的靶向分析方法灵敏度高，更适于特征肽的检测; 确定了每个特征肽最佳的碎片离子质量，进一步的生物样品分析结果表明，I1（AYLAVPAAPK）、I2（DYNSPTLIGWVK）、I5（AGYTVNNTPK）和I6（SISSGYTSGR）更适合作为金黄色葡萄球菌的候选特征肽。本研究为大规模验证候选特征肽的鉴定效果奠定了基础，为特征肽检测策略在食源性致病菌检测中的应用提供了参考。

    关键词食源性致病菌; 金黄色葡萄球菌; 特征肽; 液相色谱质谱联用

    1引 言

    食源性致病菌严重威胁人类健康与公共卫生安全。食源性致病菌可以在宿主体内繁殖，并表达毒力因子，进而损伤机体健康。尽管公共卫生水平在不断提高，但时至今日食源性致病菌引起的疾病仍频发[1，2]。建立准确高效的检验检疫方法，对于食源性致病菌危害的控制、食品安全监管和保障人民身体健康极其重要。

    金黄色葡萄球菌是一种典型的食源性致病菌，常用的检测方法有凝固酶法、酶联免疫法（ELISA）、荧光PCR法等。凝固酶方法基于致病性葡萄球菌产生的凝固酶与纤维蛋白原反应产生的沉淀实现检测[3]，该方法存在灵敏度低、生物危险性大、成本高、制剂有限等缺点。酶联免疫法可以通过金黄色葡萄球菌肠毒素与抗体的相互作用实现快速检测[4]，该方法常由于检测样本中所含无关抗原，造成假阳性结果， 并且检测成本偏高。 PCR方法[5，6]的特异性好，检测速度快，然而这种基于靶标的方法局限于特定的引物，被检产品中的扩增抑制因子也会干扰检测结果。另外，遗传突变等修饰的细菌可能产生假阳性或阴性结果。最近，Ward等[7]基于一次性丝网印刷碳电极的电化学阻抗传感器实现了低浓度金黄色葡萄球菌的快速检测，但该方法依赖于特定种属的特征信号。因此，发展快速、准确的检测金黄色葡萄球菌的方法具有重要意义。

    随着生物质谱技术的飞速发展，基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDITOF MS）已被广泛用于菌种的快速鉴定[8，9]，其在分析速度和易用性方面具有优势，但仍然依赖于菌落的分离和样品纯度。高效液相色谱电喷雾三重四极杆质谱（HPLCESI/QQQ MS）在多反应检测模式（MRM）下，由于对母离子和子离子的靶向选择，可实现极低浓度目标物的超高灵敏检测和定量分析，该技术在食品检疫中常被用于检测农药残留和非法添加等[10，11]。理论上，采用该技术对致病微生物中的特征多肽序列进行检测[12]，可实现致病微生物的灵敏检测。KruhGarcia等[13]采用LCMS/MS对结核病人血清中活性结核菌的Mtb蛋白特征肽进行靶向分析，揭示了可用于诊断结核病的潜在生物标记物。Jamnongkan等[14]通过MRM模式比较胆管癌（CCA）患者和正常人的血清的差异肽，发现了4种可用于临床预防及诊断的糖蛋白。Rees等[15]利用LCMS/MS的MRM模式检测金黄色葡萄球菌噬菌体K，评价了金黄色葡萄球菌对克林霉素和头孢西丁的抗药性。Charretier等[15]采用靶向LCMS/MS检测特征肽的方法，对临床样品中的金黄色葡萄球菌进行菌种鉴定，并对抗生素抗性和毒力进行了评估;通过文献比对和软件预测筛选出候选的特征肽，并对其使用效果进行了考察，证明了通过靶向分析特征肽检测金黄色葡萄球菌的可行性。但是，目前尚缺乏对上述策略进行验证和评估的研究报道。将该方法和策略拓展到食品中致病微生物的检测具有重要意义。

    建立候选特征肽的靶向分析方法，并考察和比较多种候选特征肽用于菌株鉴定的分析效能，对于基于特征肽检测食源性致病菌的研究至关重要。本研究考察了非靶向分析方法对金黄色葡萄球菌的候选特征肽的检测效果，建立了基于多反应监测（MRM）模式的靶向分析方法，比较和评价了不同候选特征肽的检测效能，为通过特征肽检测食源性致病菌建立方法学基础。

    2实验部分

    2.1仪器与试剂

    UPLCQExactive 超高效液相色谱四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱 （美国赛默飞世尔科技公司）; Triple QuadTM 4500 UPLCMS/MS液相色谱质谱联用系统（美国SCIEX公司）; JY92IIDN 超声波细胞粉碎机（宁波新艺超声设备有限公司）; MilliQ Advantage A10超纯水制备系统（美国密理博公司）。 乙腈（色谱纯，天津康科德科技公司）; 甲酸（色谱纯，德国Sigma公司）; NaCl和NH4HCO3（分析纯，天津博欧特化工贸易有限公司）; 蛋白胨和酵母提取物（英国Oxoid公司）。

    金黄色葡萄球菌标准菌株ATCC 43300和ATCC 25923来自天津海关动植物与食品检测中心。9条候选特征肽（纯度≥98%），由南京杰肽生物科技有限公司合成，详细信息见表1。

    2.2实验方法

    2.2.1金黄色葡萄球菌的培养金黄色葡萄球菌ATCC 43300和ATCC 25923采用营养琼脂培养基（1% 蛋白胨，0.5% NaCl，0.3% 牛肉膏，2% 琼脂），在37℃培养24 h。

    2.2.2样品前处理用接种环刮取培养皿上生长的菌落，悬浮在2 mL生理盐水（0.85% NaCl）中。取1 mL， 以8000 r/min离心15 min，沉淀重悬于200 μL缓冲液（50 mmol/L NH4HCO3，pH 8.0）中，离心洗涤一次。将细菌重悬（100 μL 50 mmol/L NH4HCO3， 10 mmol/L DTT，pH 8.0），超声破碎5 min。8000 r/min离心，取上清液，在室温、避光条件下，使用25 mmol/L碘乙酰胺进行烷基化。按蛋白量与胰蛋白酶质量比25∶1添加胰蛋白酶，在50℃水浴消化15 min[16]。用0.5 μL甲酸酸化樣品终止胰蛋白酶消化。消化后的样品直接分析，或在[email protected]@20℃下储存，待分析。

    2.2.3非靶向蛋白质组分析采用UPLCQ Exactive对金黄色葡萄球菌标准菌株ATCC 43300和ATCC 25923进行非靶向蛋白质组鉴定分析，再通过Mascot软件鉴定蛋白质种类。

    液相色谱条件： Vydax C18色谱柱（150 mm× 2.1 mm，5 μm）; 流速0.2 mL/min; 进样量10 μL; 流动相A为水，流动相B为乙腈，均含0.1 %甲酸。洗脱程序： 0～5 min，5% B; 5～30 min，5%～40% B; 30～40 min，95% B。

    质谱条件： 加热电喷雾离子源（HESI）; 正离子模式; 采用全扫描模式，粒子范围： m/z 300～1500; 分辨率70000; Ctrap最大容量（AGC target）： 100000; Ctrap最大注入时间： 100 ms; 鞘气速度： 40 arb; 辅助气流速： 3 arb; 喷雾电压： 3.5 kV; 毛细管温度： 300℃。

    Mascot软件鉴定蛋白质条件： 蛋白质数据库选择SwissProt，蛋白酶种类选择胰蛋白酶，最大漏切位点1个，固定修饰选择Carbamidomethyl（C），可变修饰选择Oxidation（M），分子量误差： 1.2 Da; 电荷类型选择1+，2+，3+。

    2.2.4LCESI/QQQ的MRM模式靶向分析采用Triple QuadTM 4500 UPLCMS/MS系统对候选特征肽进行MRM靶向分析。

    色谱条件： Vydax C18色谱柱（150 mm×2.1 mm， 5 μm）; 流速0.3 mL/min; 进样量2 μL; 流动相A相为0.1 %甲酸溶液，B相为含0.1 %甲酸的乙腈溶液。洗脱程序为，0～3 min，2% B; 3～20 min， 2%～45.5% B。

    质谱条件： 采用正离子模式和MRM模式; Turbo V离子源雾化温度： 550℃; 离子喷雾电压： 5500 V; 幕帘气流： 172.2 kPa; 碰撞气流： 68.3 kPa; GS1（Ion source gas 1）雾化气流： 413.7 kPa; GS2（Ion source gas 2）辅助气流： 379.2 kPa; MRM分析方法详见表1。

    3结果与讨论

    理想的致病微生物特征肽，能够严格区分目标微生物菌株与其它种属的微生物菌株。依靠单一肽很难满足该要求，需要综合使用多个特征肽进行鉴定。本研究考察的金黄色葡萄球菌的9种候选特征肽I1～I9（表1），由计算机消化和预测而获得[16]，来自文献报道的金黄色葡萄球菌的7种特征蛋白质。其中，I1和I2来源于金黄色葡萄球菌双功能自溶素（Bifunctional autolysin）[17]，该蛋白在细胞分裂周期结束时切开连接子细胞的肽聚糖，对菌体增殖有重要意义; I3来源于毒力因子EsxA（Virulence factor EsxA）[18]，I5、I6来源于与毒力相关的葡萄球菌分泌抗原ssaA2（Staphylococcal secretory antigen ssaA2）[18]，其对宿主感染的建立起重要作用; I4来源于核糖体蛋白L20（50S ribosomal protein L20）[19]，该蛋白直接与23S核糖体RNA结合，是50S核糖体亚基体外组装的必要条件，参与翻译过程; I7来源于磷酸丙糖异构酶[20]， 参与糖异生途径，催化二羟基丙酮磷酸（DHAP）转化为d甘油醛3磷酸（G3P）; I8来源于Probable tautomerase SA1195.1[21]; I9来源于UPF0457 protein SA1975.1[21]。

    3.1金黄色葡萄球菌中候选特征肽的非靶向分析

    本研究采用非靶向蛋白质组分析方法检测金黄色葡萄球菌的特征肽。非靶向蛋白质组分析方法不需要针对特征肽建立和优化特定的方法，易于实施，而且能够获得不限于特征肽的更丰富的多肽和蛋白质种类信息[22，23]。在金黄色葡萄球菌两个标准菌株ATCC 43300和ATCC 25923样品中分别鉴定到5种蛋白质，其中，特征蛋白和特征多肽的鉴定结果如图1所示。本研究成功鉴定出7种特征蛋白，但各自鉴定到的肽段种类数量不同（图1A），特征蛋白ATL鉴定到的多肽数量最多，在ATCC 25923样品中共鉴定出20种多肽。I1～I9中，只有4个特征肽（I2、I3、I7和I9）被成功鉴定到（图1B）; 其它特征肽可能是因为含量较低，所以不能被鉴定到。非靶向蛋白质组分析方法虽然获得的信息较多，但是检测灵敏度不高，需要开发靶向分析方法用于特征肽的高灵敏度和全覆盖分析检测。

    3.2候选特征肽靶向分析方法的考察

    利用HPLCESI/QQQ 质谱的MRM分析模式，可对特定的母离子子离子对进行选择性检测，进而提高目标物的检测灵敏度。Skyline工具可以通过计算机模拟预测碎片离子， Charretier等[15]使用该工具为每个候选特征肽筛选了3个碎片离子， 用于MRM模式分析。为验证其特征碎片离子的有效性，本研究对特征肽的碎片离子进行了全扫描分析，发现部分特征肽的碎片离子不正确或者不合适，因此，在此基础上对特征碎片离子进行了调整。图2展示了特征肽I1调整前后的特征碎片离子。由图2A可知，碎片离子m/z 766.48和653.39响应较高，而m/z 929.5并没有响应，说明该碎片离子不适合。图2B为I1碎片离子的全扫描质谱图，在m/z值较大且响应高的3个碎片离子m/z 766.48、653.39和58235，选用m/z 582.35作为碎片离子更合适。图2C为选择m/z 766.48、653.39和582.35作为特征碎片离子进行MRM模式分析的质谱图，3个特征碎片离子都有较高的响应。经调整后，最终采用的候选特征肽碎片离子见表1。以候选特征肽I1的同位素标记肽为内标，该内标肽IS位于羧基端的赖氨酸（K）增加了8 Da，所以导致y离子也都增加了8 Da，其MRM模式分析方法见表1。采用MRM模式靶向分析特征肽等量混合物（0.1 mg/mL）的色谱如图3所示， 可见同一浓度下各个特征肽的响应强度有差别，其中，I4和I1的响应最强，而I8和I9的响应较低。特征肽的質谱响应能力越强，在同等浓度下更容易被检出，响应能力很差的肽段不适于作为特征肽。由于不同肽在实际样品中的丰度不同，候选肽作为特征肽是否适合，还取决于实际生物样品中的检出效能。

    3.3金黄色葡萄球菌候选特征肽的靶向分析

    采用所建立的候选特征肽的MRM靶向分析方法，分析两种金黄色葡萄球菌菌株ATCC 43300和ATCC 25923胰蛋白酶水解样品中的候选特征肽，结果见图4。两种菌株水解物中候选特征肽的响应存在差异。在菌株ATCC25923水解样品中，I1、I2、I5和I6的响应强度较高，明显高于在菌株ATCC 43300水解样品中的响应强度。候选特征肽I1～I6在菌株ATCC43300水解样品中的响应强度较高，适合作为特征肽使用。候选特征肽I7～I9在两种菌株水解样品中响应强度都很低，甚至未检出，显然不太适合作为特征肽。候选特征肽的响应虽然在两种菌株样品中存在差异，但都被检出。

    4结 论

    本研究针对文献报道的9种金黄色葡萄球菌特征肽进行了深入研究， 比较了不同的分析模式以及分析效能的差异。结果表明， 非靶向质谱分析方法尽管获得的蛋白鉴定信息更多，但靈敏度不足以覆盖大多数候选特征肽，高灵敏度的靶向质谱分析方法依然是首选方案。通过对标准肽的碎裂分析，修正了部分碎片离子的选择。 通过检测两株金黄色葡萄球菌样品中的候选特征肽，初步表明I1、I2、I5和I6的检出效能更好，更适合作为金黄色葡萄球菌的特征肽，而I7、I8和I9因响应较低不适合作为特征肽。本研究初步考察了金黄色葡萄球菌的特征肽用于菌种鉴定的性能，下一步还需要扩大金黄色葡萄球菌株的检测数量，以提供更多、更可靠的信息。

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