超高效液相色谱串联四极杆飞行时间高分辨质谱用于太平洋鳕鱼脂质轮廓分析

    蓝皓慧 王昕岑 张晓梅 张鸿伟 丛培旭 徐杰 薛长湖

    

    

    

    摘要建立了超高效液相色谱串联四极杆飞行时间高分辨质谱（UPLCTriple TOFMS/MS）分析脂质轮廓的方法。 色谱柱选用ACQUITY UPLC CSH C18柱（150 mm× 2.1 mm， 1.7 μm），流动相A为乙腈水（65∶35， V/V），流动相B为异丙醇乙腈（85∶15， V/V），两者均含5 mmol/L甲酸铵和0.1%甲酸;质谱采用IDA自动二级扫描模式。13类脂质标准品在一定浓度范围内具有良好的线性关系，线性相关系数（R2）均大于0.995，检出限（LOD）为0.001～0.25 μmol/L，定量限（LOQ）为0.0025～0.2 μmol/L，相对标准偏差（RSD）均小于10%，大部分标准品的回收率大于80%。采用氯仿甲醇（2∶1，V/V）提取太平洋鳕鱼肌肉组织中的脂质，共鉴定出498个脂质分子种类，包括255个磷脂、52个鞘脂、191个甘油酯，主要亚类分别为磷脂酰乙醇胺、鞘磷脂、甘油二酯。本方法具有高灵敏、高分辨和高通量等优点，可用于太平洋鳕鱼脂质轮廓的分析，为脂质组学在水产品领域中的应用奠定了方法学基础。

    关键词脂质轮廓; 超高效液相色谱串联四极杆飞行时间高分辨质谱; 磷脂; 鞘脂; 太平洋鳕鱼

    1引 言

    脂质组学是代谢组学的一个分支，是对脂质进行系统分析的一门学科，主要研究内容为脂质及其代谢物的分析鉴定、脂质的生物功能與代谢调控、脂质的代谢途径及网络等[1]。自2003年被提出后[2]，脂质组学得到了快速发展，在结肠癌[3]、肝癌[4]等多种癌症的临床早期预防和筛查、代谢疾病的检测[5，6]、脂质生物标志物的发现[7]和药物靶点的鉴定[8]等研究中发挥了重要作用。近年来，脂质组学被逐渐应用于食品领域，为食品组分的脂质分析提供了快速、准确、高通量的方法[9，10]，同时也为食品掺假分析和溯源追踪提供了新的研究思路。张耀利等[11]建立了基于大气压化学电离质谱快速分析食用油中甘油三酯的方法，发现了泔水油和煎炸油的差异。Li等[12]采用超高液相色谱串联四极杆静电场轨道阱质谱分析羊奶、豆奶、牛奶的脂质组成，筛选出可作为牛奶类型区分的14种脂质标志物，为奶类鉴定和掺假分析提供了依据。

    由于食品脂质组学发展较晚，水产品中脂质种类和结构复杂，因此，关于水产品脂质组学的研究还处于初期阶段。Chen等[13]采用“鸟枪法”脂质组学技术对牡蛎中的磷脂进行了分析，其中包括29种磷脂酰胆碱、23种磷脂酰乙醇胺、11种磷脂酰丝氨酸、6种磷脂酰肌醇和17种溶血型磷脂。“鸟枪法”脂质组学技术通常采用直接进样，大大缩短了分析时间，但难以分析低丰度的脂质。Song等[14]建立了快速蒸发电离质谱（REIMS）鉴别鲑鱼和虹鳟鱼脂质的方法，共鉴定出12种脂肪酸和37种磷脂分子，用于鲑鱼产品真实性的判断依据。尽管REIMS技术在食品真伪及质量快速检测领域具有较好的应用前景，但其主要应用于定性分析，而难以用于定量分析。丛培旭等[15]建立了高效液相色谱串联三重四极杆质谱（HPLCQQQMS/MS）定量检测海参和海胆中单唾液酸神经节苷脂的分析方法，HPLCQQQMS/MS比较适合脂质成分的定量分析，但其分辨率较低，易受相近m/z的离子干扰。超高效液相色谱串联四极杆飞行时间高分辨质谱（UPLCTriple TOFMS/MS）具有高通量、高分辨率、高速等优点，通过一次进样即可实现对多种脂质分子准确地定性和定量分析[16]。

    太平洋鳕鱼（Gadus macrocephalus），又名为大头鱼，为生活在海洋底层的冷水性鱼类，广泛分布于中国的黄海和渤海地区[17]， 肉质鲜美，营养价值高，是重要的经济鱼类之一[18]。然而，有关太平洋鳕鱼脂质的研究报道较少。本研究采用超高效液相色谱串联四极杆飞行时间高分辨质谱（UPLCTriple TOFMS/MS）建立了水产品脂质轮廓分析方法，对流动相中甲酸铵浓度和质谱碰撞能进行了优化， 用于太平洋鳕鱼的脂质种类及含量分析和营养价值评价。

    2实验部分

    2.1仪器与试剂

    Nexera UHPLC LC30A超高效液相色谱系统（日本岛津公司）; TripleTOF 5600高分辨质谱仪和Analyst 1.6.3、PeakView 2.2、MultiQuant 3.0数据处理软件（美国AB Sciex公司）; ACQUITY UPLC CSH C18柱（150 mm×2.1 mm，1.7 μm，美国Waters公司）; Hypersil GOLD柱（150 mm×4.6 mm， 3 μm，美国Thermo Scientific公司）; MilliQ超纯水系统（美国Millipore公司）; DUC1C氮吹仪（日本Taitex公司）; CP1MX高速冷冻离心机（日本Hitachi公司）。

    氯仿、甲醇、异丙醇（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）; 氯仿、甲醇、乙腈、异丙醇（色谱纯，美国Thermo Fisher公司）; 甲酸、甲酸铵（色谱纯，美国SigmaAldrich公司）; 脂质标准品： 溶血磷脂酰胆碱LPC （19∶0）、磷脂酰胆碱PC （14∶0/14∶0）、溶血磷脂酰乙醇胺LPE （14∶0）、磷脂酰乙醇胺PE （14∶0/14∶0）、磷脂酰丝氨酸PS （14∶0/14∶0）、磷脂酰甘油PG （14∶0/14∶0）、磷脂酸PA （14∶0/14∶0）、磷脂酰肌醇PI（混标）、鞘磷脂SM （d18∶1/12∶0）、神经酰胺Cer （d18∶1/17∶0）、脑苷脂GalCer （d18∶1/12∶0）、甘油二酯DAG （17∶0/17∶0）、甘油三酯TAG （17∶0/17∶0/17∶0）（美国Avanti Polar Lipids公司）。

    2.2标准溶液的配制

    2.3LCMS/MS分析

    2.3.1色谱条件色谱柱： ACQUITY UPLC CSH C18柱（150 mm×2.1 mm， 1.7 μm）; 柱温： 50℃; 自动进样器温度： 4℃; 流动相A为乙腈水（65∶35， V/V），流动相B为异丙醇乙腈（85∶15， V/V），两者均含5 mmol/L甲酸铵和0.1%甲酸。梯度洗脱： 0～2 min，85%～70% A; 2～3 min，70%～60% A; 3～15 min，60%～25% A; 15～20 min，25%～1% A; 20～25 min，1% A; 25～26 min，1%～85% A; 26～30 min，85% A。流速： 0.35 mL/min。

    2.3.2质谱条件电离模式： ESI+和ESI-（各脂质的电离模式见表2）; 喷雾电压（ISVF）： ±5500 V; 离子化温度（TEM）： 500℃; 雾化气（GS1）： 50 psi（1psi=6.89 kPa），辅助加热（GS2）： 50 psi; 气帘气（CUR）： 35 psi; 扫描范围： m/z 150～1200; IDA自动二级扫描模式; 碰撞能： 45 eV; 进样量： 5 μL。

    2.4样品处理

    采用Folch法提取样品脂质[19]。取0.5 g粉碎的鱼肌肉组织，置于具塞离心管中，重复做6个平行，分别加入9 mL氯仿甲醇（2∶1， V/V），冰浴下均质，振荡提取10 min，再加入3 mL超纯水，涡旋1 min，4℃下5000 g离心10 min，收集下层溶液，上层水相再加入9 mL氯仿甲醇（2∶1， V/V）重新提取，合并下层溶液。40℃下，N2吹至干得到总脂，用1 mL异丙醇乙腈（2∶1， V/V）复溶， 过0.22 μm有机滤膜后，[email protected]@20℃保存，待测。

    2.5数据处理

    将质谱采集数据导入LipidView进行非靶向定性分析，在脂质数据库中搜索母离子和子离子碎片信息，分析结果输出后，导入PeakView进行靶向定性分析，查看每个脂质分子种的色谱、一級和二级质谱信息，确定分子种组成、保留时间和特定碎裂行为，手动过滤假阳性结果。脂质定性结果直接导入MultiQuant进行定量分析，最终获得准确的脂质含量信息。

    3结果与讨论

    3.1色谱条件的优化

    3.1.1色谱柱的选择选择Hypersil GOLD柱（150 mm×4.6 mm， 3 μm）和ACQUITY UPLC CSH C18柱（150 mm×2.1 mm， 1.7 μm）两种色谱柱，采用表1中C3的标准品混合液，考察各类脂质标准品提取离子流色谱的保留时间、峰强度和峰宽，结果见表3。ACQUITY UPLC CSH C18色谱柱利用桥式亚乙基杂化颗粒技术控制颗粒表面电荷数量，为小分子化合物分析提供良好的峰形和柱效，所以大部分脂质的峰宽在0.3 min内，相比于Hypersil GOLD色谱柱，色谱峰的峰形和响应值均更佳。此外，ACQUITY UPLC CSH C18柱可在30 min内完成所有脂质成分的洗脱和分离，更适合快速高通量分析。因此，选用ACQUITY UPLC CSH C18柱（2.1 mm×150 mm， 1.7 μm）作为分析柱。

    3.1.2流动相中甲酸铵浓度的优化通过改变流动相中甲酸铵的浓度（0、5和10 mmol/L），采用表1中C3的标准品混合液，考察各类脂质标准品提取离子流色谱峰峰宽和峰强度，确定最优的甲酸铵浓度。结果表明，甲酸铵浓度对部分磷脂的峰形有很大影响，PI、PG和PS的峰形在一定程度上得到了改善，

    3.2质谱条件的优化

    设定碰撞能（CE）分别为30、45和60 eV，对标准混合液进行分析，确定最优CE。结果表明，当CE=45 eV，CES=15 eV时，能够获得清晰的特征碎片信息，可得到满意的质谱结果。

    3.3脂质结构鉴定

    不同类别的脂质化合物在二级质谱中具有特征裂解规律，在不同的化学键位点断裂而产生特异性产物离子或中性丢失碎片离子，13类脂质的碎片离子见表2。根据各类脂质裂解规律，鉴定脂质组分的结构。以PE （16∶0/20∶5）和DG （18∶4/20∶5）两种脂质分子为例，在负离子模式下，PE （16∶0/20∶5）形成分子量为736.4958的[M-H]准分子离子，m/z 140.0137和196.0397为PE的特征子离子，m/z 255.2346和301.2191分别是断裂的C18∶4和C20∶5脂肪酸失去一个氢原子产生的碎片离子（图2A）。在正离子模式下，DG （18∶4/20∶5）与流动相中的NH+4结合，形成分子量为652.4943的[M+NH4]+， m/z 333.2410和359.2558分别是酯键断裂后丢失C20∶5和C18∶4脂肪酸产生的碎片离子（图2B）。

    3.4方法学验证

    3.4.1线性范围按表1中混合标准溶液浓度从低到高（C8～C0）顺序依次进样，每个浓度重复进样3次，以各类脂质分子的峰面积平均值为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。各类脂质对应的线性方程、相关系数（R2）、线性范围见表4，在一定浓度范围内，回归系数均大于0.995，表明线性关系良好。

    3.4.2灵敏度将表1混合标准溶液浓度从低到高（C8～C0）依次进样，以信噪比S/N=3时的浓度为检出限（LOD）， S/N=10时的浓度为定量限（LOQ）。各类脂质的检出限和定量限见表4。由于拖尾问题影响色谱峰形，PA检测灵敏度略低，除PA外，其它脂质均有较高的检测灵敏度。

    3.4.3精密度和回收率分别在0.5 g鱼肉组织中加入表1中C3浓度水平的标准溶液，按照2.4节进行样品处理，记作样本1; 不加鱼肉组织进行同样处理，记作样本2; 加入鱼肉组织，不加标准品，进行相同处理，记作样本3。样本1按照方法分析6次，用相对标准偏差（RSD）评价精密度。分别测定样本1、2、3，测得峰面积，并按照公式（1）计算回收率（R，%）：

    R（%）=（ATest-ASample）AStandard×100%（1）

    方法的精密度和回收率见表4。13类脂质的精密度均小于10%，且大部分脂质的回收率都高于80%，表明方法的精密度和回收率良好。

    3.5方法应用

    利用上述优化的实验方法，对太平洋鳕鱼的脂质轮廓进行分析，通过外标标准曲线法对样品中的各类脂质进行定量分析。图3A和B为太平洋鳕鱼脂质提取物的正负离子总离子流图，各类脂质的保留时间见表5。在太平洋鳕鱼中共鉴定出498个脂质分子种类，包括255个磷脂、52个鞘脂、191个甘油酯（表5）。根据定量分析结果计算出鳕鱼中各类脂质百分含量（图4）。结果表明，鳕鱼中的脂质主要为甘油酯和磷脂; DAG是甘油酯的主要成分，占总脂质47.3%; PE为鳕鱼磷脂的最主要成分，占总脂质13.0%; 鞘脂中SM含量最高，占总脂质2.4%。

    分析结果表明，太平洋鳕鱼中磷脂占总脂质的34.0%，且含有7种不同的磷脂亚类，PC和PE为主要的磷脂亚类，二十碳五烯酸（EPA，C20∶5）和二十二碳六烯酸（DHA，C22∶6）是磷脂中主要的脂肪酸（图3C）。已有研究表明，海水鱼与淡水鱼的脂肪酸组成不同，海水鱼中DHA和EPA的比例最高[20]，而淡水魚中花生四烯酸（AA，C20∶4）和二十二碳五烯酸（DPA，C22∶5）的比例较高; 海水鱼磷脂中DHA和EPA的含量比山羊奶、豆奶和牛奶中高得多[11]。因此，太平洋鳕鱼磷脂种类丰富、含量高，且富含DHA和EPA，是磷脂的良好来源。

    对鞘脂分析发现，SM、Cer和脑苷酯（HexCer）是太平洋鳕鱼的鞘脂成分，其中SM和Cer是其主要成分。由图3D可知，d19∶3为Cer中含量最高的长链碱（LCB），其次是d18∶1，d19∶3在哺乳动物中比较罕见[12]。鞘脂在调节细胞生长到细胞死亡和衰老等多种生物过程中发挥着重要作用[21]，近年来， 鞘脂生物活性的研究报道逐渐增加，而对鱼类脂质的研究主要集中在多不饱和脂肪酸（PUFA）、磷脂和甘油酯方面[22]。因此，本研究对鞘脂进行了分析，有助于深入了解太平洋鳕鱼的脂质代谢和营养价值。

    4结 论

    建立了基于UPLCTriple TOFMS/MS脂质轮廓分析方法。方法线性范围宽，灵敏度、精密度和回收率均较高，满足脂质组学高通量定性和高准确度定量分析的要求。对太平洋鳕鱼脂质分子种类和含量进行了全面系统的研究，单次进样即可鉴定出498种脂质分子，包括255种磷脂、52种鞘脂、191种甘油酯。本研究分析的众多脂质分子种类可为鳕鱼营养价值研究提供可靠的依据，所建立的分析方法将为水产品脂质组学提供方法学支持，为脂质组学在水产品科学中的应用奠定基础。

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