13C稳定同位素示踪技术在小硅藻光合膜脂合成途径中的应用

    李双 洪梦蓉 王春芳 陈树兵 徐继林 陈娟娟

    

    

    

    摘 要 采用13C 稳定同位素示踪技术结合高分辨质谱方法，研究了小硅藻中4类光合膜脂（二酰甘油单半乳糖脂（MGDG）、二酰甘油双半乳糖脂（DGDG）、二酰甘油硫代糖脂（SQDG）和磷脂酰甘油（PG））的合成途径。与通过物质含量的变化进行合成与代谢途径研究的传统方法相比，本方法更直观、准确地阐明了小硅藻光合膜脂中碳原子的去向。研究结果表明，小硅藻中4类光合膜脂均被标记，且标记含量在小硅藻生长周期的整个平台期逐渐增加。对二级质谱碎裂片段分析结果表明，光合膜脂的空间结构在13C标记方面起着决定性作用，即4类光合膜脂的极性头部被优先标记，其次是甘油骨架，最后是两条脂肪酸酰基链，且两条脂酰链的位置差别影响不大，几乎是同步合成。本方法可以直观准确地阐明小硅藻中光合膜脂对碳原子的利用途径，为相关研究提供了参考。

    关键词 13C稳定同位素示踪;小硅藻;光合膜脂;四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱

    1 引 言

    海洋微藻作为滩涂贝类的主要饵料，其脂类组成直接影响滩涂贝类的脂类合成，进而影响贝类的口感和风味。光合膜脂作为微藻体内的主要极性脂类，对细胞膜结构、能量储存、物质代谢转化均起重要作用[1～3]。光合膜脂包括极性头部、甘油骨架和脂酰基链，根据极性头部差异分为二酰甘油单半乳糖脂（MGDG）、二酰甘油双半乳糖脂（DGDG）、二酰甘油硫代糖脂（SQDG）和磷脂酰甘油（PG）。针对海洋微藻光合膜脂合成途径的常规研究方法，主要通过测定不同生长阶段脂质含量变化实现，研究对象包括脂肪酸、甾醇等。研究表明，绝大多数脂肪酸不以游离态存在于生物体内，而是以脂肪酰基的形式存在于各种甘油糖脂、甘油磷脂、鞘脂、三酰甘油等脂类分子中，这些分子是生物体内最直接的活性单元结构[4～8]。

    同位素示踪被认为是研究代谢途径最明晰的技术手段，与放射性同位素相比，13C、2H、18O 等稳定同位素标记技术更灵敏、稳定，可长时间示踪，且不会造成放射性辐射损伤，已广泛用于食物营养关系的研究[9～12]。同位素比例质谱技术针对生物体内全部脂质同位素标记情况进行示踪，但无法对标记后的特定脂质进行分析。研究表明，稳定同位素示踪技术结合高分辨质谱分析手技术可以直接示踪食物或药物中脂质的代谢，包括甾脂、磷脂、三酰甘油、鞘脂以及酰基辅酶A等[13～15]，并可通過多级质谱技术，获得同位素标记的具体位置。目前，利用同位素示踪技术探究海洋微藻中光合膜脂合成途径的研究比较少。宗春光等[16]利用13C稳定同位素示踪技术探究小硅藻在整个生长周期被标记总脂在含量方面的变化，但未指出脂质的具体标记位置[16，17]。

    本研究将13C稳定同位素示踪技术和高分辨质谱技术用于海洋微藻光合膜脂合成途径研究中，以13C标记的小硅藻为研究对象，在分辨率70000条件下，直接采集目标化合物的高准确度质量数（分辨率>70000，m/z 200），在精确到实际脂类分子结构和组成的水平上，阐明小硅藻中光合膜脂的合成途径，为研究脂类代谢途径，以及探究贝类对饵料微藻特征脂类同化规律提供了新思路。

    2 实验部分

    2.1 仪器与试剂

    Q-Exactive四极杆静电场轨道阱高分辨质谱仪（配H-ESI II源）、UltiMate3000高压液相色谱（配自动进样器）、Thermo Hypersil Gold C18（色谱柱100 mm ×2.1 mm，1.9 μm，美国Thermo Fisher Scientific公司）;Milli-Q超纯水制备仪（美国Millipore 公司）;冷冻干燥机（美国Labconco公司）;旋转蒸发仪（德国IKA公司）。

    二酰甘油单半乳糖脂（MGDG）、二酰甘油双半乳糖脂（DGDG）、二酰甘油硫代糖脂（SQDG）和磷脂酰甘油（PG）标准品（≥99%，美国Sigma-Aldrich公司）;甲酸（色谱纯，美国Sigma-Aldrich公司）。其它均为色谱纯试剂（德国Merck公司）。实验用水为Milli-Q超纯水（18.2 MΩ cm）。NaH13CO3中13C/12C比值为99%（美国Sigma公司）。

    2.2 小硅藻光合膜脂类13C同位素标记

    小硅藻（Nitzschiaclosterium f. minutissima）由宁波大学海洋生物实验室藻种室提供。培养海水（pH 8.30，盐度28‰）在使用前经过0.45 μm醋酸纤维滤膜过滤后，煮沸，冷却，培养液采用f/2 配方[16]： 75 mg/L NaNO3，5 mg/L NaH2PO4，20 mg/L Na2SiO3，3.15 mg/L FeCl3·6H2O，4.36 mg/L EDTA-Na2，10 mg/L CuSO4·5H2O，22 mg/L ZnSO4·7H2O，10 mg/L CoCl2·6H2O，18 mg/L MnCl2·4H2O，6.3 mg/L NaMoO4·2H2O，1 mg/L VB12，1 mg/L Biotin 和 200 mg/L Vitamin B1。将培养液置于2500 mL的锥形瓶中，光强3000～4000 lux，（20±2）℃，每天摇晃3次，利用血球计数板计数。将收集的藻液以4500 r/min离心5 min，收集下层藻泥，冷冻干燥后，于80℃保存，每组实验设3个平行。

    小硅藻单种培养至平台初期，摇匀后各取600 mL均分至18个锥形瓶，分成实验组和对照组，每组9瓶。实验组各添加0.6 g NaH13CO3，对照组各添加0.6 g NaHCO3，同时充氮气 30 min后密封，以排除剩余CO2干扰。之后每两天添加NaH13CO3（实验组）和 NaHCO3（对照组）各0.1 g，添加前充氮气，以确保NaHCO3或NaH13CO3作为微藻生长的唯一碳源。连续培养10天，在第4、7和10天分别收集两组样品，冷冻干燥后，于80℃保存。

    2.3 总脂提取

    称取藻粉50 mg，采用改进后的 Bligh-Dyer 法提取总脂[18]。取50 mL提取液（三氯甲烷-甲醇-水，1∶2∶0.8，V/V），振荡5 min，超声15 min，转移至分液漏斗，静置30 min，取下层溶液，氮气吹至近干，用甲醇定容至1.0 mL，过0.22 μm滤膜，待分析。

    2.4 仪器条件

    HPLC色谱条件： Hypersile Gold C18色谱柱（100 mm×2.1 mm，5 μm），柱温40℃，进样量： 10 μL。流动相A为乙腈-异丙醇（3∶1，V/V）溶液，流动相B为水-乙腈（1∶2，V/V）溶液，均加入5 mmol/L醋酸锂;流速 0.3 mL/min;梯度洗脱： 0～15 min，0%～50% A;15～17 min，50%～100% A;17～19 min，100% A;19～19.1 min，100%～0% A;19.1～23 min，0% A。

    质谱条件： 采用正/负离子扫描，质量范围m/z 100～1000，分辨率70000 （m/z 200），自动增益控制（AGC）目标值5×105。测定SQDG和PG时，采用负离子模式，毛细管电压值2700 V;测定MGDG和DGDG时，采用正离子模式，毛细管电压值3500 V。离子传输管温度300℃;鞘气（N2）流速： 35 L/h;辅助气（N2）流速： 10 L/h;气化室温度350℃，仪器运行前进行校正。二级质谱，分辨率35000;自动增益控制（AGC）目标值2×105;碰撞能量范围25%～40%; 保留时间采集范围： 根据一级色谱图中各个目标物质的保留时间值±1.0 min。

    2.5 光合膜脂13C同位素的定性和定量分析

    13C同位素标记后化合物分子结构不受影响，同源化合物会呈现共流出现象，色谱保留时间完全一致，通过对比保留时间可初步确定化合物的存在形式，并参考文献[19～23]，对二级质谱扫描产生的特征离子碎片进行解析（误差值<5×10?6），综合判断，进行定性分析;通过提取每类光合膜脂的特征离子碎片，并对13C同位素标记后峰面积叠加，进行13C同位素的定量分析。

    3 结果与讨论

    3.1 小硅藻的培养

    采用血球计数板计量藻种密度并绘制生长曲线，由图1可知，小硅藻培养的0～9天属于对数期，10～20天为平台期，从21天开始进入衰败期。研究表明，小硅藻体内脂类化合物在平台期大量合成并积累，因此选择处于平台初期的小硅藻进行标记实验。藻种培养至平台初期后，分别取600 mL均分至18个锥形瓶，划分成实验组和对照组，按照2.2节方法，进行小硅藻光合膜脂类13C同位素标记。

    3.2 提取液的选择

    光合膜脂是总脂类化合物的主要组成部分，根据待测化合物的性质，采用Blight-Dyer法[18]，即采用三氯甲烷-甲醇-水 （1∶2∶0.8，V/V） 对小硅藻中总脂进行提取，3种溶剂的极性范围覆盖广，完全满足脂类化合物的提取要求。

    3.3 仪器条件的优化

    通过直接进样的方式对单标进行质谱分析，比较正/负离子模式下的响应强度，确定每类化合物的最佳电离方式。结果表明，MGDG和DGDG在正离子模式下响应强度明显优于负离子模式，且形成的碎裂片段也更为丰富，而含电负性集团的SQDG和PG更易形成[M-H]峰。

    光合膜脂作为低极性化合物，很难通过弱酸或弱酸盐促进离子化，产生高丰度[M+H]+。因此，流动相中加入强离子化试剂醋酸锂，并考察了不同添加量（2、5和10 mmol/L）的影响。结果表明，流动相中含有5和10 mmol/L醋酸锂时，目标化合物离子响应值达到最大，因此，选择在流动相中添加5 mmol/L醋酸锂作为助离子化试剂。此外，考察了乙腈-异丙醇的体积比（5∶1、3∶1、1∶1）对色谱峰形的影响，结果表明，乙腈-异丙醇（3∶1，V/V）作为流动相A时获得了最优的色谱峰形、分离效果和保留时间。

    3.4 13C同位素定性分析

    MGDG和DGDG在ESI+模式下，形成的分子离子峰包括[M+Li]+和[M+Na]+，以[M+Li]+作为基峰，并对13C同位素标记后的[M+Li]+进行二级质谱分析，推测13C的具体标记位置。MGDG的[M+Li]+二级质谱产生特征碎片离子m/z 227.11 [C9H16O6Li]+，是极性头部单半乳糖CO键断裂，经过重排反应得到一個Li+后形成的;DGDG的[M+Li]+二级质谱扫描，产生特征碎片离子m/z 405.14[C15H26O11Li]+，是极性头部双半乳糖CO键断裂，经过重排反应得到一个Li+后形成的;负离子扫描模式下，SQDG的极性头部可产生m/z 225.03 [C6H9O7S]的特征碎片离子;PG可产生m/z 227.03 [C6H12O7P]、m/z 171.01 [C3H8O6P]和m/z 153.00 [C3H6O5P]特征碎片离子。根据中性丢失酰基链后产生的碎裂片段可用于确定酰基组成及位置分布[19～23]。R

    以MGDG-（20∶5～16∶2）为例，分别提取对照组（图2A）和实验组（图2B和图2C）m/z 779.5269（保留时间（RT） 9.30 min）进行一级质谱图差异性分析。与图2A相比，图2B在m/z 779.5269 [M+Li]+和m/z 795.5012 [M+Na]+的基础上，出现了两簇新的质谱峰，分别为m/z 785.5474和802.6144;在图2B基础上，图2C增加一簇新的质谱峰m/z 819.6035。将13C同位素标记后新出现的化合物m/z 785.5474、 802.6144和819.6035分别提取，并将得到的提取离子色谱图同原化合物m/z 779.5269进行比较，发现此类化合物呈现共流出现象，色谱保留时间完全一致（RT 9.30 min），可初步确定是同种化合物的不同标记形式（图3）。

    通过对上述化合物，包括对照组的m/z 779.5269和13C同位素标记后的m/z 785.5474、802.6144、819.6035进行二级质谱扫描，对产生的碎裂片段进行质谱解析，进一步确定13C同位素的具体标记位置（图4）。由图4A可知，m/z 779.5269在碰撞能下产生的主要碎裂片段离子有3个： m/z 227.1063 [C9H16O6Li]+是极性头部单半乳糖CO键断裂，经过重排反应得到Li+后形成的，可作为MGDG特征片段离子;m/z 475.3151 [M+Li-R2COOH]+和m/z 529.3255 [M+Li-R1COOH]+，是酰基链在母离子基础上发生中性丢失后形成的，酰基链分别为FA 20∶5和FA 16∶2，通过比较丰度值，可最终确定此化合物为MGDG-（20∶5～16∶2）。

    13C同位素标记后的m/z 785.5474较对照组m/z 779.5269分子量增加6 Da，说明MGDG-（20∶5～16∶2）中有6个C被优先标记。由图4B可知，m/z 785.5474产生的主要碎裂片段离子有3个： 极性头部m/z 227.1063 [C9H16O6Li]+转变为m/z 233.1299 [13C6C3H16O6Li]+（Δ=6 Da），表明极性头部基团含有的6个C被标记;中性丢失酰基链后的两个碎裂片段m/z 481.3142和535.3447，较对照组m/z 475.3151和m/z 529.3255分子量均增加6 Da，表明13C同位素标记第4天时，极性头部单半乳糖基团含有的6个C被优先标记，而两条酰基链均未被标记。

    13C同位素标记后的m/z 802.6144较对照组m/z 779.5269分子量增加23 Da，表明化合物MGDG-（20∶5～16∶2）有23个C被标记。由图4C可知，m/z 802.6144在碰撞能下产生的主要碎裂片段离子有3个： 极性头部m/z 227.1063 [C9H16O6Li]+转变为m/z 236.1402 [13C9H16O6Li]+（Δ=9 Da），表明极性头部含有的9个C均被标记;中性丢失酰基链后的两个碎裂片段： [M+Li-R2COOH]+由m/z 475.3151转变为m/z 481.3072（Δ=6 Da），表明sn-2酰基链有23-6=17个13C原子被标记，[M+Li-R1COOH]+由m/z 529.3255转变为m/z 552.3492（Δ=23 Da），表明sn-1酰基链有23-23=0 13C被标记，即sn-1酰基链未被标记。通过m/z 785.5474进一步验证，m/z 802.6144较13C同位素标记的m/z 785.5474分子量增加了17 Da，表明13C同位素标记第10天时，该化合物在极性头部单半乳糖6个13C被优先标记外，又有17个13C被标记，分别为极性头部甘油骨架的3个13C，sn-2酰基14个13C和sn-1酰基未被标记。

    13C同位素标记后的m/z 819.6035比m/z 779.5269分子量增加40 Da，表明化合物MGDG-（20∶5～16∶2）有40个13C被标记。由图4D可知，m/z 819.6035在碰撞能下产生的主要碎裂片段离子有3个： 极性头部m/z 236.1400 [13C9H16O6Li]+含有的9个C均被标记;进一步分析中性丢失酰基链后的碎裂片段，[M+Li-R2COOH]+由m/z 475.3151转变为m/z 499.3636（Δ=24 Da），表明sn-2酰基链有40-24=16个13C原子被标记;另一个丢失酰基链后的碎裂片段[M+Li-R1COOH]+由m/z 529.3255转变为m/z 554.4081（Δ=25 Da），表明sn-1酰基链有40-25=15个13C原子被标记。通过m/z 802.6144进一步验证，m/z 819.6035化合物较13C同位素标记的m/z 802.6144分子量增加了17，表明13C同位素标记第10天时，该化合物在极性头部9个13C及sn-2号酰基14个13C被标记外，又有17个13C被标记，分别为sn-2酰基增加的2个13C和sn-1酰基的15个13C。

    光合膜脂MGDG、DGDG、SQDG和PG结构组成相似，均可按照上述13C同位素标记后的MGDG定性分析方法，对产生的碎裂片段进行质谱解析，进一步确定13C同位素的具体标记位置。结果表明，小硅藻中4类光合膜脂均被标记，且标记含量在小硅藻生长周期的整个平台期逐渐增加。二级质谱碎裂片分析结果表明，光合膜脂的空间结构在13C标记优先性方面起决定性作用，即4类光合膜脂的极性头部被优先标记，其次是甘油骨架，最后是两条脂肪酸酰基链，且两条脂酰链的位置差别影响不大，几乎是同步合成。

    3.5 13C同位素定量分析

    小硅藻中4类光合膜脂MGDG、DGDG、SQDG和PG均被13C同位素标记。小硅藻平台期13C同位素标记含量计算有两种方法。第一种方法是通过提取一级质谱中13C同位素标记后母离子精确质量数的色谱峰面积进行叠加定量。以MGDG-（20∶5～16∶2）为例，共含有45个C，标记情况最多包括45种： 即m/z 779～824，覆盖了MGDG-（20∶5～16∶2）經13C同位素标记后的状态，通过提取这45个m/z值同一保留时间（9.3 min）提取离子色谱图，并对峰面积叠加，得到MGDG-（20∶5～16∶2）13C同位素标记后的含量值。对于MGDG类化合物13C同位素标记后的总含量值，则需要对每种MGDG13C同位素标记后的含量值进行加和。小硅藻中光合膜脂酰基组成种类众多，4类光合膜脂MGDG、DGDG、SQDG和PG经13C同位素标记后的含量计算非常繁琐。

    第二种方法是根据上述13C同位素标记定性分析结果，即4种光合膜脂的极性头部优先标记。因此，除了对一级质谱中13C同位素标记后母离子精确质量数的色谱峰面积进行叠加定量外，还可以通过提取特征碎片离子（极性头部）色谱图，通过峰面积叠加进行13C同位素标记的定量分析。以MGDG为例，特征碎片离子为m/z 227 [C9H16O6Li]+，此碎裂片段共含有9个C，标记情况最多有9种（m/z 228～236），完全覆盖了所有MGDG经13C同位素标记后的所有状态。通过提取这9个m/z值同一保留时间的提取离子色谱图，并对峰面积叠加，即可对每种MGDG的13C同位素标记情况进行定量，而提取这9个m/z值对应所有保留时间的提取离子色谱图，并对峰面积叠加，即可对总的MGDG的同位素标记情况进行定量（图5）。同样，m/z 405.14 [C15H26O11Li]+作为DGDG的特征碎片离子、m/z 225.03 [C6H9O7S]作为SQDG的特征碎片离子、m/z 171.01 [C3H8O6P]和m/z 153.00 [C3H6O5P]作为PG的特征碎片离子，均可按照上述13C同位素标记的定量方法完成。

    小硅藻中4类光合膜脂均被标记，且标记含量在小硅藻生长周期的整个平台期逐渐增加。其中，SQDG的13C同位素标记值在第10天达到最高（（1.20±0.08） μg/mg干粉），其次MGDG、PG和DGDG的13C同位素标记值在第10天达到最高，依次为（0.78±0.05） μg/mg、（0.51±0.03） μg/mg和（0.39±0.03） μg/mg干粉（图6）。

    4 结 论

    利用稳定同位素示踪技术结合高分辨质谱分析手段，直接示踪小硅藻中4种光合膜脂合成途径，并通过多级质谱技术，获得13C同位素标记的具体位置，直观准确地阐明了小硅藻光合膜脂中碳原子的去向。小硅藻中4类光合膜脂均被标记，空间结构在13C标记优先性方面起决定性作用，即4类光合膜脂的极性头部被优先标记，其次是甘油骨架，最后是两条脂肪酸酰基链，且两条脂酰链的位置差别影响不大，几乎是同步合成，标记含量在小硅藻生长周期的整个平台期逐渐增加。本研究为后期探究缢蛏对微藻脂类生物标记物的同化过程提供了参考。

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