耗散型石英晶体微天平实时监测氧化损伤红细胞与内皮细胞的粘附

    肖苏婷 姚政 周琳 杨培慧

    

    

    

    摘?要?红细胞与血管内皮细胞之间的粘附作用研究对揭示心血管疾病的发病机制具有重要意义。在病理状态下， 红细胞的氧化损伤会使胞膜糖蛋白受体中的唾液酸含量下调以及细胞粘弹性质的改变，导致红细胞与血管内皮细胞的黏附性增强。基于唾液酸与3-氨基苯硼酸具有特异性识别作用，本研究采用耗散型石英晶体微天平（QCM-D）建立了一种实时监测氧化损伤红细胞与内皮细胞之间粘附的新方法。以H2O2氧化损伤红细胞为研究模型，通过QCM传感器实时监测红细胞粘附过程频率和耗散因子的变化， 评价其氧化损伤程度。结果表明，随着H2O2浓度增加，QCM频率和耗散因子变化值均随之减小，表明红细胞的粘附与H2O2浓度和红细胞的氧化损伤程度呈负相关。为了模拟血管内环境，将血管内皮细胞固定于芯片界面，采用QCM实时监测其与红细胞的粘附，结果表明，随着红细胞损伤程度增加，细胞间的黏附逐渐增强。 本研究建立了一种简便、免标记、高灵敏、可实时监测细胞间粘附并评价细胞氧化损伤的新方法，拓展了QCM技术在生物体系细胞功能研究中的应用范围。

    关键词?紅细胞; 氧化损伤; 内皮细胞; 黏附; 石英晶体微天平

    1?引 言

    红细胞（Red blood cells， RBCs）和血管内皮细胞（HUVECs）的损伤与黏附是导致心血管疾病发生的初始因素。RBCs膜表面含有胞膜糖蛋白C3b 受体，其主要成分为唾液酸，也是RBCs负电荷的主要来源，能够阻止RBCs聚集。在生理条件下，正常RBCs与血管内皮细胞几乎不发生黏附; 在病理条件下，如受到氧化损伤时RBCs膜的唾液酸表达量会下调，并发生细胞形态改变和变形能力下降，导致RBCs与血管内皮细胞的黏附增强[1]。研究表明，多种疾病的发生机制与RBCs和内皮细胞间的黏附性增强有关[2]。因此，发展简便、灵敏、免标记的分析方法实时监测RBCs与内皮细胞的黏附，对深入了解心血管疾病的发病机制具有重要意义。

    石英晶体微天平（Quartz crystal microbalance， QCM）是一种具有纳克级灵敏度的新型质量传感分析技术，通过监测石英晶体的共振频率变化（Δf）可反映晶体表面吸附物质的质量变化，具有高灵敏、免标记、可实时监测等优点[3，4]。耗散型石英晶体微天平（Quartz crystal microbalance with dissipation， QCM-D）可通过监测耗散因子（ΔD）的变化反映晶体表面吸附物质的粘弹性变化，进而反映细胞的形变和硬度。近年来，在细胞黏弹性、细胞粘附和细胞力学性质等方面的研究备受关注 [5～7]。Muramatsu等[8]利用QCM结合显微镜技术监测活细胞对抗肿瘤药物的响应和粘附过程。Cui等[9]利用QCM-D技术实时监测内皮细胞和巨噬细胞在脑蛋白/肝素复合膜上的黏附和扩散，显示了细胞在含有不同成分薄膜中具有不同的粘附机理。Noiri等[10]通过化学偶联构建聚乙二醇/磷脂复合膜并修饰RGD多肽用于粘附人脐静脉内皮细胞，表明细胞粘附行为受液体流动式样的影响。Yang等[11]构建了聚乙烯亚胺/透明质酸复合膜界面用于特异性识别乳腺癌细胞过表达的CD44分子，以QCM传感器评估具有不同迁移能力的MDAMB-231和MCF-7乳腺癌细胞的粘附行为。Zhu等[12]以QCM传感器监测人脐静脉内皮细胞在金芯片上的粘附、扩散和增殖，并以H2O2氧化损伤内皮细胞，导致其在金芯片上的扩散和覆盖面积下降，且此过程与H2O2浓度呈正相关。Shoaib等[13]以QCM-D传感器实时监测H2O2氧化损伤MC3T3小鼠成骨细胞的粘弹性，显示了氧化损伤对细胞骨架和细胞形态的影响。本研究组利用QCM传感器结合质量型纳米粒子信号放大技术定量检测了RBCs膜表面的唾液酸[14]，并通过氧化损伤血管内皮细胞，采用QCM传感器实时监测了RBCs与内皮细胞间的黏附作用[15]。由于在病理条件（如氧化应激、高血糖等）的刺激下会引起RBCs损伤和胞膜糖蛋白C3b 受体中唾液酸表达量下调，导致RBCs与血管内皮细胞间的黏附增强，因此，发展QCM传感器表征氧化损伤RBCs与血管内皮细胞之间的粘附作用，将有助于理解心血管疾病的发病机制，并同时为细胞功能研究提供新思路。

    因此，本研究以H2O2氧化损伤RBCs为研究模型，基于氧化损伤RBCs引起的膜表面唾液酸表达量下调和细胞粘弹性改变导致RBCs与内皮细胞间的黏附增强， 采用QCM-D传感器实时监测氧化损伤RBCs与血管内皮细胞间的粘附（如图1所示）。利用3-氨基苯硼酸（3-Aminophenylboronic acid， APBA）特异性识别RBCs膜表面的唾液酸，以APBA功能化的金芯片捕获RBCs，通过频率变化监测不同损伤程度RBCs的黏附; 以聚赖氨酸（Polylysine， PLL）非特异性界面通过粘附内皮细胞模拟血管内环境，通入损伤RBCs，连续追踪细胞间的粘附，为表征细胞间的粘附以及细胞功能研究提供了新方法。

    2?实验部分

    2.1?仪器与试剂

    KSV Z-500石英晶体微天平（KSV Instrument公司）; CHI660a电化学工作站（上海辰华仪器有限公司）; Zetasizer Nano Zeta电位仪（英国马尔文仪器有限公司）; 5 MHz AT切型金芯片（晶体直径14 mm，电极直径10 mm，深圳市仁路科技有限公司）。

    APBA、 PLL、1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（1-（3-Dimethylaminopropyl）-3-ethylcarbodiimide hydrochloride， EDC）、 N，N-二甲基甲酰胺（N，N-Dimethyl formamide， DMF）均购自美国Sigma公司，巯基丁二酸（Mercaptosuccinic acid， MSA）、维生素C（Vitamin C， Vc）均购自上海阿拉丁试剂公司，以上试剂均为分析纯; 30% H2O2（上海阿拉丁试剂公司）; 槲皮素（Quercetin， Que， 纯度97%，上海源叶生物科技有限公司）; 胎牛血清、RPMI-1640培养基、0.25%胰蛋白酶、磷酸盐缓冲溶液 （Phosphate buffer saline， PBS）均购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司; 实验用水为超纯水。

    2.2?内皮细胞的培养和RBCs的处理

    HUVECs来源于暨南大学医学院，接种于含有10%胎牛血清和1%内皮细胞生长添加物的RPMI-1640培养基中，在5% CO2、37℃的培养箱中培养，每隔2～3天进行传代。用0.25%胰蛋白酶消化内皮细胞，并取对数生长期的HUVECs用于QCM实验。

    正常人全血来源于暨南大学附属第一医院，按照文献[13]的方法从正常人全血中分离出RBCs，接着用0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L H2O2分别处理RBCs 2 h，再用PBS清洗并离心得到不同氧化损伤程度的RBCs悬液。Que保护RBCs的处理方法是在1.0 mL PBS中加入RBCs悬液0.1 mL，再加入50 μmol/L Que处理10 min，接着加入0.6 mmol/L H2O2溶液调节至总体积为2.0 mL，作用2 h。维生素C处理RBCs的方法与Que相同。

    2.3?QCM-D的测量

    金芯片的预处理： 用超纯水超声清洗15 min，再用Piranha溶液（30% H2O2-H2SO4， 1∶3， V/V）清洗5 min，然后交替用30%乙醇和蒸馏水各清洗3次，最后用N2吹干，备用。在干净的金芯片表面滴涂5 mmol/L MSA，室温过夜后，用乙醇和水依次交替清洗2～3次。将修饰的MSA金芯片用2.0 μg/mL PLL孵育2 h，用超纯水清洗除去过量的PLL，得到MSA/PLL功能化金芯片; 用100 mmol/L EDC的DMF溶液处理15 min，活化金芯片表面的羧基，加入20 mmol/L APBA孵育1 h，然后用蒸馏水冲洗金芯片上过量的APBA，得到APBA功能化金芯片。

    将功能化金芯片安装于QCM流通池中，设置流速为200 μL/min，调节系统温度控制保持25℃，通入PBS缓冲溶液待基线稳定，通入1 ×105 cells/mL RBCs或内皮细胞，记录谐波次数n=3时Δf和ΔD随时间变化的曲线。

    2.4?电化学实验方法

    采用上海辰华公司CHI660a电化学工作站，以QCM流通池作为电化学池，电解质溶液为10 mmol/L [K3Fe（CN）6]3/4+ 0.1 mol/L KCl溶液，采用三电极体系：金芯片工作电极、铂对电极和Ag/AgCl参比电极，扫描速率100 mV/s，电压范围0.2～0.6V，记录循环伏安曲线。

    3?结果与讨论

    3.1?APBA修饰传感界面的表征

    基于APBA对唾液酸的特异性识别，构建了APBA功能化金芯片界面粘附RBCs，并用QCM和循环伏安法进行表征。由图2A可知，随着RBCs通入流通池QCM频率变化（|Δf|）明显增大，由于生理状态RBCs表面表达有唾液酸，其与芯片界面APBA特异性识别发生粘附作用，从而引起频率明显下降，表明RBCs粘附于传感器界面。如图2B所示，Au/MSA/APBA/RBC的层层修饰阻碍了金芯片的电子传递，导致氧化还原峰电流下降，进一步表明了RBCs在传感器界面上的粘附。将损伤RBCs和正常RBCs分别通入流通池，其频率随时间的变化曲线如图2C所示，损伤RBCs因膜表面的唾液酸含量下调，导致粘附性能下降，其频率变化低于正常细胞。上述结果表明，构建的QCM传感器能有效地监测损伤RBCs与正常RBCs在芯片界面粘附行为的差异。

    3.2?QCM传感器实时监测氧化损伤RBCs的黏附

    以不同浓度H2O2处理RBCs，采用QCM传感器于监测不同氧化损伤程度的RBCs黏附。由图3A可见，频率变化值|Δf|随着H2O2浓度增大而降低，由于受H2O2氧化损伤，RBCs唾液酸表达量下降，RBCs在传感界面粘附减少，|Δf|值回升，表明RBCs的粘附与H2O2浓度和RBCs氧化损伤程度呈负相关; 图3B为不同浓度H2O2处理RBCs的Zeta电位图，Zeta电位随H2O2浓度升高而降低，说明氧化损伤的RBCs所带负电荷减少，是由于RBCs膜表面带负电荷的唾液酸表达量下调，这与文献[16]的结果相符。因此，QCM传感器可对不同氧化损伤程度的RBCs产生灵敏的信号响应。此外，所构建的APBA功能化传感界面粘附RBCs具有良好的稳定性，通常可重复使用3次，QCM频率测量值的相对标准偏差为6.7%。

    3.3?QCM-D传感器监测氧化损伤RBCs的粘弹性

    氧化损伤RBCs会导致细胞力学性质发生变化，在此可用聚赖氨酸非特异性界面QCM-D传感器监测不同损伤程度RBCs的耗散因子ΔD随频率的变化，并以细胞粘弹性指数|ΔD/Δf|表征细胞粘弹性，其值越大，细胞粘弹性越大，细胞形变能力也越大。由图4A和图4B可知，|ΔD/Δf|值随着处理浓度的增加而下降，说明RBCs的粘弹性降低，细胞形变能力下降。由文献[16]可知，RBCs氧化损伤会导致形变能力下降。进一步将50 μmol/L抗氧化劑AA和Que应用于降低RBCs的氧化损伤，如图4C所示，相对于单独0.6 mmol/L H2O2处理组，抗氧化剂保护组的粘弹性指数更接近对照组，而且与对照组相比，抗氧化剂组不存在显著性差异（p>0.05），表明抗氧化剂对RBCs具有保护作用。

    3.4?QCM传感器实时监测损伤RBCs与内皮细胞间的粘附

    以聚赖氨酸非特异性界面粘附血管内皮细胞模拟血管内环境，在流通池中通入损伤RBCs，利用QCM传感器实时监测RBCs与内皮细胞间的粘附。QCM行为曲线如图5A所示，其中的Ⅰ区、Ⅱ区和Ⅲ区分别表示QCM频率响应的PBS基线区、内皮细胞粘附界面区和RBCs粘附区，从Ⅲ区的曲线可知，损伤RBCs的频率变化明显大于正常RBCs，说明在血管内皮细胞表面，氧化损伤RBCs比正常细胞具有更强的黏附能力，这与文献[17]报道正常RBCs的粘附能力较弱相符。此外，第Ⅲ区域的频率变化随着处理RBCs的H2O2浓度的增加而增大，如图5B所示，随着RBCs氧化损伤程度的增加，RBCs与内皮细胞间的粘附作用增强。

    4?結 论

    基于QCM发展了一种免标记、高灵敏、连续监测氧化损伤RBCs与血管内皮细胞粘附过程的新策略。通过构建特异性识别唾液酸的APBA功能化传感界面和模拟血管内环境的血管内皮细胞传感界面，成功监测到RBCs的黏附和细胞粘弹性均与H2O2浓度呈负相关，并连续追踪了损伤RBCs与血管内皮细胞的粘附行为，进而可评估RBCs的氧化损伤程度。本研究为表征细胞间的粘附以及细胞功能研究提供了新方法。

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