4-硝基苯甲酰氯柱前衍生-超高效液相色谱/质谱法测定烟叶中氨基酸

    黄曼艳　陈森林　林云　陶红　阿文伟　胡玉玲　叶为民　李攻科

    

    

    

    摘 要 建立了4-硝基苯甲酰氯柱前衍生、超高效液相色谱/质谱法测定烟叶中氨基酸的方法。样品经超声辅助提取后，提取液与4-硝基苯甲酰氯可快速发生衍生化反应。优化后的衍生化条件为： NH4HCO3-NH3·H2O缓冲溶液（pH=9.0）， 室温下振荡衍生1 min。此反应具有反应条件温和、衍生时间短等优点。通过优化多通道反应监测参数，进一步提高了方法的灵敏度。方法的线性相关系数R2在0.9951～0.9998之间，检出限为0.01～2.10 μg/L，加标回收率为81.7%～103.6%，相对标准偏差为0.5%～8.0%，具有良好的稳定性和精密度。采用本方法测定3种不同产地烟叶样品中氨基酸含量，结合多元统计分析方法进行分析，分类效果良好。

    关键词 4-硝基苯甲酰氯; 液相色谱-质谱联用; 衍生; 氨基酸; 煙叶

    1 引 言

    氨基酸是烟叶中的初级和次级代谢产物，在陈化过程中，与还原糖发生酶及非酶催化反应或自身降解生成致香成分，是烟叶中重要的香气前体物质。烟叶中氨基酸的组成和含量与烟叶的品质有关，每种氨基酸对香味的贡献值不同。总氨基酸含量与评吸总得分呈现二次曲线的相关关系，与烟叶品质密切相关。因此，常作为检测烟叶品质的重要指标，在烟叶中品质研究中具有重要作用[1，2]。

    烟叶中氨基酸测定方法主要有气相色谱法[3，4]、离子色谱法[5，6]、液相色谱法[7]和氨基酸流动分析法[8]等。由于氨基酸不易挥发，当采用气相色谱检测时，常与N，O-双（三甲基硅烷基）三氟乙酰胺（N，O-bis（trimethylsilyl） trifluoroacetamide， BSTFA）等衍生化试剂反应生成易挥发物质后进行测定。由于BSTFA遇水易失效，对反应条件要求较苛刻，稳定性较差[9]。采用离子色谱测定时，基质离子干扰较大，会影响定量分析的准确性。而氨基酸不具有紫外和荧光吸收，虽可采用液相色谱-质谱联用测定，但氨基酸极性大，不易保留，离子化效率较低[10，11]。因此，柱前衍生仍是目前氨基酸检测的重要手段。食品和烟叶中氨基酸的检测主要采用茚三酮作为柱前衍生试剂结合氨基酸流动分析仪进行测定，而柱前衍生结合液相色谱进行检测较为简便、灵敏和快速。常用的柱前衍生试剂主要有荧光胺（Fluorescamine， FA）、丹磺酰氯（Dansyl chloride， dansyl-Cl）[12，13]，在衍生的过程中，会产生副产物，影响衍生产物的测定。氯甲酸-9-芴基甲酯（Fluorene methyl chloroformate， FMOC-Cl）[14]水解产物有荧光干扰，过量的衍生化试剂需用戊烷除去，操作繁琐，定量结果偏差较大; 2，4-二硝基氟苯（2，4-Dinitrofluorobenzene， DNFB）[15]衍生过程中需要避光处理，容易产生副产物; 6-氨基喹啉-N-羟基琥珀酰亚胺基氨基甲酸酯（AQC）[16]是氨基酸衍生化试剂，加热衍生5 min即可完成，但试剂较昂贵，且多余的衍生化试剂水解后也会产生较强的紫外吸收，其保留时间与丙氨酸接近，对丙氨酸的测定产生干扰。为提高衍生反应速率，减少实验操作步骤，实现批量烟叶样品的快速测定，发展氨基酸衍生化新方法具有重要意义。 4-硝基苯甲酰氯作为醇类、胺类物质等[17～19]的衍生化试剂，其酰氯基团可与氨基酸中的氨基迅速发生酰基化反应，而硝基又可降低衍生试剂的水解速度，因此具有反应条件温和、衍生时间短、简便快速等特点。

    本研究采用4-硝基苯甲酰氯作为衍生化试剂，与LC-MS/MS联用测定烟叶中的氨基酸，并探究了不同产地烟叶中氨基酸含量的差异。结果表明，4-硝基苯甲酰氯可作为一种新型氨基酸衍生化试剂，应用于烟叶中氨基酸的测定。

    2 实验部分

    2.1 仪器与试剂

    LC-MS 8050超高效液相色谱-三重四极杆质谱仪（日本岛津公司）; H1850高速离心机（湖南湘仪离心机有限责任公司）; AB204-S电子天平、Mettler-Toledo FE20 台式酸度计 （瑞士梅特勒-托利公司）; KQ5200数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）; 0.22 μm聚四氟乙烯过滤器（上海安谱科学仪器有限公司）; 色谱柱Shim-pack XR-ODS Ⅲ（200 mm × 2.0 mm，2.2 μm， 日本岛津公司）。

    20种氨基酸分析标准品（纯度>98%，上海源叶生物科技公司）， 均为L构型; 乙腈（色谱纯，DIMA公司）; 甲酸（色谱纯， Sigma公司）; 4-硝基苯甲酰氯、3，5-二硝基苯甲酰氯、3-硝基苯甲酰氯（色谱纯，北京百灵威科技有限公司）; 其它试剂均为分析纯。实验用水均为超纯水（18.25 MΩ·cm，美国Millipore公司）。烟叶样品由广东中烟公司提供。

    2.2 标准溶液和样品的制备

    分别称取10.0 mg氨基酸标准品，用水溶解并定容至10.0 mL，稀释配成10.0 mg/L混合母液，于4℃避光保存，待用。采用 0.1 mol/L NH4HCO3-NH3·H2O缓冲溶液（pH 9.0）稀释，配制二级标准储备液，采用逐级稀释法配成一系列浓度的混合标准溶液。4-硝基苯甲酰氯采用无水乙腈配成10.0 mg/L的衍生试剂溶液。

    按照YC/T31-1996《烟草及烟草制品试样的制备和水分测定烘箱法》[20]处理烟叶样品。 准确称取100.0 mg样品，加水萃取10 min后，离心分离后所得的上清液用0.22 μm的水相滤膜过滤，得到萃取液。取100 μL萃取液，采用0.1 mol/L NH4HCO3-NH3·H2O缓冲溶液（pH 9.0）稀释至10.0 mL，待用。

    2.3 衍生化反应

    室温下，取900 μL 10.0 μg/L氨基酸混合标准溶液，加入100 μL 10.0 mg/L 4-硝基苯甲酰氯衍生化试剂，振荡1 min后进样分析，完成萃取衍生，经0.22 μm 聚四氟乙烯 （PTFE） 滤膜过滤后进行测定。其反应方程式如下式。

    NO2+H2NCHRCOOHpH=9NO2ONHCHRCOOH

    2.4 色谱和质谱条件

    色谱柱Shim-pack XR-ODS Ⅲ（200 mm×2.0 mm， 2.2 μm）; 流动相A为0.1%甲酸，B为乙腈; 梯度洗脱： 0～15 min， 5%～70% B; 15～20 min， 70%～5% B，流速为0.3 mL/min，柱温35℃，进样量20 μL。

    电喷雾离子源（ESI）; 毛细管电压3.0 kV; 离子源温度300℃; 脱溶剂气温度400℃; 脱溶剂气流量650 L/h; 锥孔气流量50 L/h; 负离子扫描模式，选择多反应监测（MRM）模式分析。

    2.5 数据处理

    应用SPSS-24軟件进行主成分分析和判别分析。烟叶香型由广东中烟提供，其中1～11号产自贵州，12～23号产自湖南，24～37号产自云南。

    3 结果与讨论

    3.1 衍生反应机理

    4-硝基苯甲酰氯具有酰氯基团，可用于胺类物质的衍生，具有较高的灵敏度[21]。由于酰氯基团较易水解，引入硝基可抑制其水解的速度，当氨基酸与酰氯基团完全反应后，多余的衍生化试剂发生水解，不影响衍生产物的测定。其部分产物离子扫描图见图1，分别代表4种氨基酸，在负离子模式下均出现母离子峰，说明此衍生反应符合取代反应的过程。由图1A、1B、1C可知，当采用4-硝基苯甲酰氯为衍生化试剂时，均产生m/z 122.0和150.0的碎片离子，增大了离子的响应。此外，由图2D可知，脯氨酸作为二级氨基酸，也产生m/z 122.0的碎片离子，说明此衍生化方法具有良好的适用性，可用于烟叶中一、二级氨基酸的测定。

    3.2 MRM方法的建立

    分别取900 μL 10.0 μg/L氨基酸单标准溶液，加入100 μL 10.0 mg/L 4-硝基苯甲酰氯衍生化试剂反应后分别进行母离子和产物离子扫描，得出每个氨基酸衍生特征产物离子碎片。通过优化定量离子对、最优化碎裂电压和电离能等，最终得到20种氨基酸多反应监测（MRM）参数见表1。

    3.3 衍生条件的探究

    3.3.1 衍生试剂的选择 为了探究硝基苯甲酰氯的衍生效果，在相同的衍生条件下分别考察3-硝基苯甲酰氯、4-硝基苯甲酰氯、3，5-二硝基苯甲酰氯3种不同衍生化试剂的衍生效果，结果如图2A所示。对比主要氨基酸衍生产物峰面积可知，4-硝基苯甲酰氯衍生产物峰面积更大，其衍生的效果更好，可能是因为当硝基处于对位时，能减少位阻的影响，更有利于发生亲核取代反应。

    3.3.2 缓冲溶液pH值的选择 考察了衍生化过程中缓冲溶液pH值对衍生化过程的影响。4-硝基苯甲酰氯在碱性条件下可与氨基酸发生反应，故在碱性条件下研究pH值的影响。取10.0 mg/L氨基酸混合溶液，分别采用pH为8.0、8.5、9.0、9.5、10.0浓度为0.1 mol/L的NH4HCO3-HN3·H2O缓冲溶液稀释成10.0 μg/L溶液。采用相同的方法衍生和测定，对比峰面积的差异。由图2B可见，当pH=9.0时，除了脯氨酸的峰面积下降外，其它氨基酸的衍生效果最好，最终确定最佳pH=9.0。

    3.3.3 振荡辅助衍生 以10.0 μg/L氨基酸混合标准溶液为分析对象，考察振荡衍生时间分别为1、5、10、15和20 min时衍生反应结果。从图3A可见，随着时间增长，衍生产物峰面积差异不大，最终选择振荡衍生时间为1 min。从图3B可见，采用振荡辅助衍生的效果略优于室温下不经辅助衍生的方式，脯氨酸在振荡条件下的衍生效果较好。最终选择室温下振荡辅助衍生作为后续的衍生方式。

    3.3.4 稳定性 以10.0 μg/L氨基酸混合标准溶液为分析对象，在最佳的衍生条件下反应，探究批间和日间8 h内衍生反应产物的稳定性。通过峰面积的对比，批间相对标准偏差介于1.1%～6.0%，日间衍生产物峰面积变化不大，其相对标准偏差为2.3%～10.5%。结果表明，此衍生反应产物能够稳定存在，可以保证后续实验中氨基酸的定量分析。

    3.4 分析方法性能和实际样品的测定

    利用逐级稀释法配制氨基酸混合标准溶液，与LC-MS/MS联用进行测定，各氨基酸的线性范围、相关系数、检出限及回收率见表2，其中，天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺的线性范围为0.5～500 μg/L， 脯氨酸为0.1～1000 μg/L，其余氨基酸为0.5～100 μg/L，各氨基酸在各自线性范围内具有良好的线性相关性，线性相关系数R2在0.9951～0.9998之间，检出限为0.01～2.10 μg/L，加标回收率为81.7%～103.6%， 满足前处理和分析检测方法的要求，可用于烟叶氨基酸的测定。不同氨基酸检测方法对比结果如表3所示，此衍生化方法衍生时间短，操作简便快速，检出限低，可用于氨基酸含量的检测。图4A和4B分别为标准溶液色谱图和烟叶样品色谱图。

    3.5 不同产地烟叶样品的判别分类

    选择3个产地的37份烟叶样品，采用本方法测定烟叶中氨基酸的含量，并结合判别分析方法对样品进行分类和判定。样品的KMO值为0.811，样品显著性较强，前3个主成分累积贡献率为83.85%，具有初步的分类效果。其样品的方差分析见电子版文后支持信息表S1所示。在表4中，将贵州、湖南、云南样品分别设定为1、2、3组，采用判别分析对样品进行分析。在自身验证中，样品均未产生误判，三者的总平均准确率为100%。在交互验证中，其中有1份贵州样品误判为云南烟叶，湖南烟叶有2份误判为云南烟叶，云南烟叶有1份误判为贵州烟叶，判别准确率分别为90.9%、83.3%和85.7%， 而交互验证的平均准确率为86.5%，说明本方法模型可应用于不同产地烟叶样品的预测。

    4 结 论

    建立了4-硝基苯甲酰氯柱前衍生与超高效液相色谱/质谱联用测定烟叶中氨基酸的方法。此衍生反应条件温和，衍生时间仅为1 min，衍生完成后可直接进行测定。采用本方法测定3个不同产地烟叶样品，结合多元统计分析对产地进行分析，判别分析的准确率为86.5%，具有良好的实用性。 本方法还可用于研究氨基酸与烟叶其它品质的关系，为烟叶质量判定提供依据。

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    Analysis of Amino Acids by Ultra High Performance Liquid

    Chromatography-Electrospray Ion Tandem Mass Spectrometry

    Using 4-Nitrobenzoyl Chloride as Precolumn Derivatization

    HUANG Man-Yan1， CHEN Sen-Lin2， LIN Yun2， TAO Hong2， A Wen-Wei1，

    HU Yu-Ling， YE Wei-Min2， LI Gong-Ke

    1（School of Chemistry， SunYat-sen University， Guangzhou 510275， China）

    2（China Tobacco Guangdong Industrial Co. Ltd.， Guangzhou 510385， China）

    Abstract A pre-column derivatization method for determination of amino acids in tobacco leaves by ultra-high performance liquid chromatography-electrospray ion tandem mass spectrometry using 4-nitrobenzoyl chloride as derivatization reagent was developed. The sample was extracted by ultrasound-assisted extraction， and then the extracts were rapidly derived with 4-nitrobenzoyl chloride. The derivative reaction was performed in NH4HCO3-NH3·H2O buffer solution at pH 9.0 and room temperature with oscillation assistance for 1 min. To enhance the sensitivity， the parameters of multiple reaction monitoring were also optimized. This method had many advantages including mild reaction condition， simple procedure and short derivatization time. The method showed a good linearity with correlation coefficients of 0.9951-0.9998. The detection limits were 0.56-2.00 μg/L with RSDs of 0.5%-8.0%. This method coupled with multivariate statistical analysis method was successfully employed for determination of amino acids in tobacco leaves from three different geographical origins， showing a good classification results.

    Keywords 4-Nitrobenzoyl chloride; Ultra-high performance liquid chromatography-mass spectrometry; Derivatization; Amino acid; Classification