高选择性过氧化亚硝酰荧光探针的合成及性能研究

    后际挺 王冰雅 郑凌云

    

    

    

    摘?要?过氧化亚硝酰（ONOO）是生物体系中重要活性氧之一，对其高效检测一直备受关注。本研究以4-二乙基氨基水杨醛和6-甲氧基-1-萘满酮为原料，经一步有机反应，合成了一种带氧鎓正离子的荧光探针PFP，用于检测ONOO。通过紫外-可见吸收光谱和荧光发射光谱系统考察了探针PFP对ONOO的光学响应。结果表明，此探针具有选择性好、灵敏度高（检出限为15.5 nmol/L）、响应快速（数秒内）、Stokes位移较大（42 nm）、水溶性好等优点。细胞毒性实验表明，探针PFP具有良好的生物相容性，探针浓度为20 μmol/L时，细胞存活率>95%。激光扫描共聚焦显微成像结果表明，此探针可用于活细胞中外源性和内源性ONOO的荧光成像研究。

    关键词?荧光探针; 活性氧; 过氧化亚硝酰; 细胞成像

    1?引 言

    作为细胞内活性氧（Reactive oxygen species，ROS）之一，过氧化亚硝酰（ONOO）是由一氧化氮（NO）和超氧根自由基（O·2）以1∶1的化学计量比，通过扩散控制的反应方式生成（k = 0.4×1010～1.9 ×1010 L/（mol s））[1]。由于其强氧化性，ONOO具有抗微生物和抗菌活性[2]; 同时，ONOO在细胞信号传导过程中起着重要作用[3]。然而，细胞内过度表达的ONOO可引起生物大分子损伤，如DNA和蛋白质的硝化失活[4～6]; 另外，ONOO还可引起线粒体功能失调。近年的研究表明， ONOO参与多种病理生理过程，如心血管疾病、炎症、癌症、药物引起的肝中毒等[7～10]，因此，ONOO被认为是一种疾病诊断的生物标志物[10]。

    基于ONOO重要的生理功能，开发可靠有效的ONOO检测手段具有十分重要的意义。目前，由于其高灵敏性、非侵入性成像、高时空分辨率等优点[11～15]，荧光分析法已成为检测生物体系中ONOO的最有效手段[16～18]。自2006年Yang等首次报道高选择性ONOO荧光探针以来[19]，研究者合成了许多不同性能的荧光探针， 用于ONOO的检测及生物成像研究[20～32]。这些探针与ONOO的作用模式主要有：硫属化合物的氧化[20，21]、硼酸或硼酸酯的氧化水解[22，23]、肼的氧化水解[24，25]、活性CC双键的氧化裂解[26，27]和N-氧化去芳基化[28，29]。虽然这些探针对ONOO表现出良好的光学响应，且已在生物体系中得到了较为广泛的应用，但都存在一些问题。例如，硼酸酯或硼酸类探针的水溶性较差并且易受HOCl和H2O2的干扰[18]; 含活性CC双键的探针则易受亲核性物质（如SO23）的影响[33，34]。此外，目前报道的大多数ONOO荧光探针的最大发射波长λmax600 nm）的荧光探针用于ONOO的生物成像，仍然具有挑战性。

    自2014年以来，本研究组先后以香豆素-吡啶盐和香豆素-喹啉盐为探针平台，通过活性CC双键的氧化裂解途径，实现了ONOO的荧光检测[35，36]。该系列探针具有良好的水溶性和选择性，但其λmax仅约为490 nm，不利于高信噪比荧光成像。最近，本研究组利用吩噻嗪衍生物构建了一个比率荧光探针，与ONOO作用后，λmax可从630 nm蓝移至480 nm，然而该探针水溶性较差，需要使用表面活性剂Triton X-100作为助溶剂[37]。

    考虑到上述工作的不足，本研究以水杨醛和萘酮为原料，通过一步缩合反应制备了一种检测ONOO的新型荧光探针PFP。此探针带有一个正电荷，具有极佳的水溶性; 同时，D-A-D电子结构使此探针在628 nm处具有较强荧光。此探针与ONOO反应后得到无荧光的产物，从而实现对ONOO的长波检测。此探针被成功用于活细胞中外源性和内源性ONOO的荧光成像，在ONOO生理功能研究方面具有潜在的应用价值。

    2?实验部分

    2.1?仪器与试剂

    JEOL ECZ600R/S3 600 MHz核磁共振仪（日本Jeol Resonance公司，TMS为内标）; Xevo G2-XS QTof质谱仪（美国Waters公司）; UV-3900型分光光度计（日本日立公司）; ?FLS 1000型荧光光谱仪（英国爱丁堡仪器公司）; Leica TCS SP8动态超高分辨单双光子激光共聚焦联用系统（德国徕卡公司）。

    4-二乙基氨基水杨醛（Ark试剂公司）; 6-甲氧基-1-萘满酮（安耐吉试剂公司）; 5-氨基-3-（4-吗啉基）-1，2，3-恶二唑鎓盐酸盐（3-Morpholinosydnonimine，SIN-1，阿拉丁试剂公司）; 脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）和干扰素（Interferon-γ， IFN-γ）（北京索莱宝科技有限公司）。实验用水为二次蒸馏水。

    2.2?探针PFP的合成

    合成路线参照文献[38]并稍作改动。具体合成路线如图1所示，将4-二乙基氨基水杨醛（1.93 g，10 mmol）和6-甲氧基-1-萘滿酮（1.76 g， 10 mmol）溶于20 mL浓H2SO4（98%），Ar保护下于90℃反应5 h。反应结束后，冷却至室温，然后倒入约200 g冰中。搅拌下缓慢加入HOCl4（70%，10 mL），将所得沉淀抽滤，并先后用大量水和少量丙酮洗涤滤渣。干燥后，得2.8 g深红色固体PFP，产率为65%。1H NMR （600 MHz， DMSO-d6） δ （ppm）： 8.58 （s， 1H）， 8.30 （s， 1H）， 7.87 （d， J=9.3 Hz， 1H）， 7.39 （d， J=9.1 Hz， 1H）， 7.32 （s， 1H）， 6.88 （s， 1H）， 3.67 （q， J=6.7 Hz， 4H）， 3.40 （s， 3H）， 2.97 （s， 4H）， 1.20 （t， J=6.9 Hz， 6H）。13C NMR（150 MHz， DMSO-d6） δ （ppm）： 163.47， 159.73， 158.62， 155.75， 148.66， 146.44， 132.32， 131.55， 126.34， 120.94， 118.37， 118.18， 118.03， 117.45， 96.37， 45.89， 26.81， 25.06， 16.76， 12.98。TOF MS： calcd.?for C22H24NO+2 334.1802， found 334.1811。

    2.3?ROS溶液配制

    O·2：用CaH2预干燥二甲亚砜（DMSO）过夜，然后将其离心（3000 r/min， 20 min），得到无水DMSO后，加入KO2，超声溶解。

    羟基自由基（·OH）：利用FeCl2和过量的H2O2现配现用。

    ONOO：将20 mL HCl（0.6 mol/L）和H2O2（0.7 mol/L）的混合溶液与20 mL NaNO2溶液（0.6 mol/L）迅速倒入到冰块上，1 s内倒入20 mL冷的NaOH溶液（1.2 mol/L）。溶液颜色由无色变为黄色，然后加入30 mg MnO2除去多余的H2O2，密封，置于20℃保存。利用紫外-可见吸收光谱标定其最终浓度（ε302=1670 L/（mol cm））。

    H2O2： 将30% H2O2稀释，通过紫外-可见吸收光谱标定其最终浓度（ε240=43.6 L/（mol·cm））。

    ClO： 将5% NaOCl稀释，通过紫外-可见吸收光谱标定其最终浓度（ε292=350 L/（mol·cm））。

    TBHP（tBuOOH）： 将70% TBHP溶液稀释至最终浓度为20 mmol/L。

    2.4?探针PFP的合成

    荧光量子产率的测定在PBS溶液中进行。使用罗丹明B（ΦS=0.69，甲醇作为溶剂）作为参比。荧光量子产率通过公式（1）计算：

    其中， Φ为荧光量子产率，A为在激发波长处的吸光度; F为激发波长处激发后的积分荧光面积; n是溶剂的折射率; 下标S和X分别代表参比和未知样品。

    2.5?光谱测定

    配制探针的DMSO母液（5 mmol/L），在磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.2～7.4，10 mmol/L）中进行光谱测试。探针浓度为10 μmol/L，激发波长为568 nm，激发和发射狭缝宽度均为1 nm。选择性实验中，所需各种底物浓度均为100 μmol/L。

    2.6?细胞成像实验

    外源性：将人乳腺癌细胞（MCF-7）置于37℃、5% CO2的培养箱中培养。在进行荧光成像实验之前，细胞用PBS清洗3次，然后加入10 μmol/L PFP培养30 min。用PBS清洗3次后，加入100 μmol/L SIN-1继续培养30 min，用PBS清洗3次后，在激光共聚焦荧光成像仪下成像。

    内源性：将MCF-7细胞置于37℃、5% CO2的培养箱中培养。在进行荧光成像实验之前，在细胞中加入LPS（1 μg/mL）以及IFN-γ（50 ng/mL）培养 24 h。加入10 μmol/L PFP继续培养30 min后， 细胞用PBS清洗3次，在激光共聚焦荧光成像仪下成像。

    成像所用激发波长为559 nm，收光窗口为600～660 nm。

    3?结果与讨论

    3.1?探针的选择性

    考察了探针PFP对活性物质的选择性。当探针浓度为10 μmol/L时，PFP在PBS缓冲液中溶解性良好，最大吸收波长位于586 nm（ε=29500 L/（mol·cm））。如图2所示，向探针溶液加入10倍摩尔比常见的细胞内ROS时，包括O·2、·OH、ONOO、H2O2、ClO及TBHP，发现在ONOO存在下，探针在586 nm处的吸收几乎完全消失; ClO可以引起探针吸收部分减弱，其它ROS则对探针的吸收光谱不产生影响。由于探针分子中存在氧鎓正离子，因此考察了亲核性物质（包括S2、SO23、半胱氨酸（Cys）和谷胱甘肽（GSH））对探针结构的影响。结果表明，这些亲核性物质与探针分子不发生反应。荧光发射光谱（图2B）显示，PFP在628 nm具有强烈的荧光发射峰，Stokes位移为42 nm。传统的长波荧光染料（如花菁、甲基蓝）通常具有较短Stokes位移（～20 nm），这导致其用于生物荧光成像实验时常出现窜光干扰。相比之下，PFP具有更大的Stokes位移，有利于荧光成像应用。类似于吸收光谱中的现象，在ONOO作用下，PFP的荧光完全被猝灭（图3A）; ?ClO引起探针荧光强度略微增强，而其它活性物质对探针发射光谱的影响很小，可忽略不计。另外，向ONOO及其它物质的混合溶液中加入探针分子，依然可观察到明显的荧光猝灭现象（图3B），说明探针对ONOO的检测能力基本不受其它物质的影响。综上，探针对ONOO具有良好的选择性和抗干扰检测能力。

    3.2?探针对ONOO的识别性能研究

    考察了探针的吸收光谱和发射光谱随ONOO浓度的变化趋势。如图4所示，随着ONOO浓度从0 μmol/L逐渐增加到200 μmol/L，探针在586 nm处的吸收峰逐渐消失，颜色从紫红色逐渐变为浅紫色。另一方面，探針在628 nm处的荧光强度也逐渐减弱，荧光量子产率从0.13降至0.03。

    由图5A中的荧光滴定曲线可见，在ONOO作用下，探针荧光的猝灭速率由快到慢; 当ONOO浓度高于50 μmol/L时，探针的荧光强度基本不再变化，此时猝灭效率达到98%，说明探针已与ONOO完全反应。如图5B所示，当ONOO浓度在0.1～5.0 μmol/L之间时，探针在628 nm处的荧光强度与ONOO浓度呈线性关系，线性方程为y=86.5-24.9x（R2=0.999），检出限（3σ/k， 其中，σ为扫描探针溶液10次得到的荧光强度的标准偏差，k为探针荧光强度与底物浓度呈线性作用区间的斜率）为15.5 nmol/L， 与文献报道数值相当（表1），说明此探针对ONOO具有较高灵敏度。

    3.3?探针对ONOO的细胞成像实验

    将此探针用于活细胞内ONOO的荧光成像研究。利用四唑盐（3-（4，5）-Dimethylthiahiazo （-z-y1）-3，5-di-phenytetrazoliumromide，MTT）比色法，对PFP的细胞毒性进行评价。将不同浓度探针与MCF-7细胞培养24 h后，发现探针浓度达到20 μmol/L时，细胞存活率依然大于95%，表明此探针具有良好的生物相容性（图7）。

    考虑到细胞内pH范围在4～8之间，为了探究细胞内不同区域pH值对探针荧光是否产生影响，在进行细胞成像实验之前，测试了探针在pH=4和pH=8条件下的稳定性。如图7B所示，探针在pH值不同的两种溶液中持续光照1 h后，其荧光强度基本不变，表明PFP适用于细胞内成像。随后，检测了探针对细胞外源性ONOO的荧光成像能力。如图8所示，将MCF-7细胞与10 μmol/L探针培养30 min后，可观察到细胞内出现强烈的红色荧光，且荧光主要分布在细胞核外，说明PFP具有良好的细胞膜渗透性。SIN-1在水溶液中易缓慢分解，在O2存在下生成NO和O·2，进而生成ONOO[40]。将细胞与探针预孵育30 min后，再与SIN-1培养30 min，细胞内红色荧光明显减弱，说明SIN-1促进了细胞内ONOO浓度升高，从而导致探针被消耗，荧光消失。

    由于ONOO是一种细胞内源性ROS，因此考察了探针对LPS和IFN-γ刺激下细胞内ONOO浓度变化的成像能力。LPS和IFN-γ能够诱导细胞表达一氧化氮合成酶（NOS2），从而促进细胞内ONOO水平的升高[20]。如图9所示，将细胞与LPS和IFN-γ孵育24 h后，再与探针培养30 min，红色荧光几乎消失，说明探针可以对细胞受刺激下产生的ONOO进行灵敏的荧光成像。

    4?结 论

    合成了一种带氧鎓正离子的荧光染料。此染料可发射628 nm强烈红色荧光，与ONOO反应后， 荧光被猝灭。此探针具有响应快速、选择性好、灵敏度高、水溶性好、Stokes位移较大、细胞毒性低等优点。可能由于探针与ONOO反应较为复杂，本研究未能成功鉴定氧化产物，反应机制有待深入探究。与荧光增强型探针相比，此探针由于本身具有强荧光，可以直观地观察其细胞膜渗透性及细胞内分布等。本研究将此探针成功应用于活细胞中外源性和内源性ONOO的荧光成像研究。此探针在细胞及活体层面上的相关病理生理过程中ONOO的荧光示踪方面具有潜在的应用价值。

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