西瓜种质资源遗传多样性分析的 SSR核心引物构建与验证

    张海英 王慧 郭绍贵 任毅 宫国义 翁益群 许勇

    目的与意义：西瓜作为重要的经济作物，在我国种植业结构调整和促进农民致富增收中发挥着重要作用。当前西瓜生产中种子质量问题比较突出和普遍，种子纯度不够和假种子坑农事件常有发生，严重干扰了种业的健康发展，也是对品种创新与知识产权保护的严重损害。常规的品种鉴定难以依靠品种形态特征进行准确、快速的品种鉴别。SSR技术具有共显性、重复性好等优点，但如果将基因组的所有SSR位点对供试种质一一进行分析，需要耗费大量的人力和物力。针对上述现有技术的问题，本研究将依据西瓜基因组序列开发一套SSR核心標记，可用于西瓜种质资源核酸指纹库构建和遗传背景等研究。

    材料与方法：（1）供试材料为北京市农林科学院蔬菜研究中心的17份重测序材料和100份遗传背景清晰的育种材料。（2）SNP数据：利用Illumina GAII测序平台对东亚生态型西瓜自交系‘97103和其他16份材料进行全基因组测序和重测序，获得的相关数据。（3）西瓜SSR核心引物的开发策略：第一，依据覆盖整个基因组的近390万个SNP位点对17份重测序材料绘制SNP系统发育树。第二，以栽培种‘97103（东亚生态类型）和‘Sugarlee（美洲生态类型）为材料，利用西瓜高密度遗传图谱中双亲表现多态的704对SSR引物，获得在2个栽培种之间中具有多态性的78对SSR引物。第三，利用上述78对SSR引物对17份重测序材料进行扩增。在此基础上，不断调整各种引物组合，最终获得23对核心引物组合。引物挑选原则是UPGMA聚类图与SNP系统发育树基本一致;PIC值大于0.45;标记数目最少和每个连锁群至少有一个标记;电泳条带清晰、便于统计。（4）数据统计与分析：利用Freetree软件的基于Nei-Li遗传相似系数的UPGMA法，计算17份重测序材料的遗传相似性并构建UPGMA聚类图，利用Powermarker v3.0软件进行117份供试材料的UPGMA聚类分析，并采用Dendroscope软件构建聚类图。

    结果与分析：（1）基于SNP标记分析17份重测序材料的遗传多样性：17个重新测序材料，共包含3 889 080个SNP，由于系统发育树是通过比较全基因组序列得到的，因此能正确显示不同测序品种的特异性。UPGMA系统发育树，将其分成2大类，与传统的植物学分类结果完全一致。（2）基于78对SSR引物分析17份重测序材料的遗传多样性：78对多态性引物，在17份重测序材料中共检测到285个等位基因变异，位点多态性信息含量（PIC）为0.11～0.82，平均0.6。利用78对多态性引物构建的UPGMA聚类图与SNP系统发育树基本一致，因此，可以将78对多态性引物作为备选引物。（3）西瓜SSR核心引物的开发与验证：根据核心引物开发策略，共获得23对核心引物（原表4）。23对核心引物，在17份重测序材料中，共检测到97个等位基因，位点多态性信息含量（PIC）为0.45-0.82，平均0.66。23个核心引物和78个备选引物构建的系统发育树图基本相同，而且其遗传相似系数矩阵之间的相关系数表现为显著相关（r=0.96，P<0.005），说明23对核心引物能够较好地代表遗传多样性信息。（4）SSR核心引物有效性验证：利用23对核心引物，对100份遗传背景明晰的育种材料和17份重测序材料进行了遗传多样性分析。UPGMA聚类图与材料的系谱分析结果基本一致。而且，23对核心引物还可以进行品种真实性检测，并有效区分形态差异很小的材料。比如‘97103和‘98R，虽然形态和生长习性比较近似，但分子检测，显示其有10%的差异。

    结? ? 论： 本研究开发的SSR核心引物，能最大限度地代表遗传多样性，很好地完成种质资源核酸指纹库构建、遗传背景、品种真实性、纯度鉴定等分析工作。