形态观察、RNA-Seq定量和表达谱分析： 南瓜砧木嫁接西瓜类胡萝卜素生物合成的新见解

    刘 广 羊杏平 徐锦华 张曼 侯茜 朱凌丽 黄莹 熊爱生

    目的与意义： 西瓜（Citrullus lanatus）属于葫芦科家族的一员，是一种重要的园艺作物，以其营养多汁的果肉闻名全世界。西瓜种植效益较高，但受枯萎病的影响，不能在同一园区实现连年栽培。嫁接技术的应用有效地解决了西瓜不能连作的难题。为了充分发掘果实发育期南瓜砧木对嫁接西瓜基因表达的影響及鉴定参与嫁接西瓜番茄红素生物合成的基因，本研究以自根西瓜、自根嫁接西瓜、南瓜嫁接西瓜果实四个发育时期的瓜瓤组织为试验材料，利用HPLC测定番茄红素的含量，并用RNA-Seq（quantification）技术及qRT-PCR进行了基因组范围内转录本的研究。

    材料与方法：（1）采用RNAiso Plus（Takara，大连，中国）的试剂盒进行果肉组织样本总RNA的提取。（2）使用RNA Pico芯片的安捷伦2100生物分析仪（美国）进行RNA浓度和质量的评估。（3）构建RNA-Seq文库，通过Illumina公司HiSeq 2000测序平台进行测序。（4）对这些文库进行了RNA-Seq量化测序。使用SOAPaligner / SOAP2软件（Li et al. 2009）对葫芦科网站上已发表的西瓜参考基因序列进行比对。（5）使用NOIseq方法确定每个基因差异表达统计的显著性（Sonia et al. 2011）。（6）使用高效液相色谱仪器分析番茄红素，在472 nm UV-V光谱检测。（7）选择了8个与番茄红素生物合成相关的差异表达基因进行qRT-PCR。实时PCR反应条件是：95 ℃ 3 min，其次是95 ℃ 10 s，58 ℃ 30 s，40个循环。然后在60 ℃进行溶解曲线分析。

    结果与分析： ①对自根西瓜（NGW）、自根嫁接西瓜（SGW）及南瓜嫁接西瓜（PGW）在果实发育时期的果实变化进行了研究。结果表明，在果形指数上，NGW、SGW、PGW之间各个时期差异不大，在成熟期时三者的果形指数均为1。在果实可溶性固形物含量方面，成熟时三者的中心可溶性固形物为13%左右，边缘可溶性固形物约为9.8%，表明嫁接对果实的可溶性固形物含量无显著影响。在单果质量方面，NGW、SGW、PGW 4个时期差异不大，成熟期时三者约为5kg，南瓜砧木未显著降低嫁接西瓜的单果质量。在果肉硬度方面，除26DAP，其余时期PGW与NGW、SGW无显著差异，南瓜砧木对嫁接西瓜果实的硬度无显著影响。（2）采用高效液相色谱法测定NGW、SGW和PGW西瓜果实在四个不同发育阶段番茄红素的含量。研究结果显示，嫁接西瓜中β-胡萝卜素含量极低，在果肉中番茄红素占主导地位。在NGW和SGW中，果实中果肉番茄红素的含量在整个果实发育成熟期明显增加，番茄红素含量最高为约35 μg·g-1 FW。然而，在PGW中，果实番茄红素含量在4个发育时期呈先增加后下降的趋势，在26 DAP时，它达到了峰值，为27 μg·g-1 FW，然后略有下降，直到成熟期34 DAP时，为24 μg·g-1 FW。（3）在这项研究中，我们对编码番茄红素合成途径的关键酶基因进行了分析。共有来自于8个与番茄红素相关的基因家族的33个基因在果肉着色和植物营养价值中发挥巨大作用。笔者对这33个基因在果实发育成熟的四个时期的基因表达情况进行了追踪。（4）在西瓜测序结果中，发现与GGPS、CRTISO和CHYe酶合成相关的基因都只有1个，分别为WMU29546、WMU64670和WMU14036。2个基因WMU38667和WMU69109参与调控PSY酶，WMU41454和WMU66972参与调控ZDS酶，基因WMU41454和WMU66972参与调控LCYb。有3个基因WMU32086、WMU04959和WMU08893参与调控PDS合成。共有21个基因参与调控CRTISO。然后根据他们的表达模式，笔者进一步将这33个番茄红素生物合成相关的差异表达基因分为4类：第一类为在果实发育四个时期都高度表达的差异基因;第二类为在果实发育后3个时期（18DAP，26DAP和34DAP）基因表达水平较高;第三类为在果实发育后两个时期（26DAP和34DAP）基因表达水平较高;第四类为在果实发育四个时期都低度表达的差异基因。在NGW、SGW和PGW中，有28个基因表达一致。有5个基因在NGW、SGW和PGW果实发育期表现不一致，基因WMU69109在NGW和PGW归为第二类，而在SGW表现为第一类;基因WMU22455在NGW和SGW中归为第二类，而在PGW表现为第一类;基因WMU23214 、WMU71326和WMU30436在NGW和SGW归为第三类，而在PGW表现为第二类。此外，PGW中发现有9个基因在果实发育期的变化趋势与两对照不一致，包括WMU66972、WMU79499、WMU71326、WMU42266、WMU64670、WMU36962、WMU71302、WMU75287和WMU14036基因。（5）结果显示，挑选的8个基因在数字表达分析和qRT-PCR分析2种方法上虽然在不同时期的表达上数据存在一些差异，但是这些基因在果实发育时期的基因表达变化上趋势大概一致。RNA-Seq和qRT-PCR在基因表达水平上具有很高的相关性（r2 = 0.61～0.97）。

    结? ? 论： 转录组分析数据提供了果实发育期间嫁接诱导基因调控番茄红素生物合成新的信息。8个基因家族（GGPS、PSY、PDS、ZDS、CRTISO、LCYb、LCYe和CHY）中33个基因的表达水平与番茄红素的生物合成有关。南瓜嫁接西瓜果实发育过程中有14个基因差异表达，这表明这些基因可能有助于调控嫁接西瓜果实中番茄红素的生物合成。