纳米硒对肉鸡六价铬中毒的影响

    赵雅丽 周东海

    

    

    

    摘要：目前肉鸡铬中毒没有具体明确的治疗方案，纳米硒在减轻重金属中毒方面作用突出。为研究纳米硒补充剂对铬（VI）（K2Cr2O7）中毒肉鸡的影响，通过高通量测序选取两个改变比较大的基因ACACA和CPT1A.，以此来探索纳米硒是否对肉鸡铬中毒具有预防和治疗作用。试验将180只一日龄肉鸡分成6组：空白对照组、铬中毒组、纳米硒保护组、纳米硒治疗组、纳米硒预防组、纳米硒对照组，每组3次重复。喂养35 d后，取出肝脏，HE染色，RT-qPCR进行验证。结果表明：①铬中毒组肉鸡的肝脏切片可见细胞破裂，轮廓不清晰，细胞核破裂，核固缩，肝窦间隙增大，中央静脉管扩张;其他组的一部分肝脏细胞处于正常状态，一小部分被破坏。②用纳米硒治疗之后，ACACA基因上调幅度降低，CPT1A基因下调幅度降低，说明纳米硒可以减轻铬对肉鸡的影响。该结论为以后研究铬中毒和治疗铬中毒提供了一个重要思路和方向。

    关键词：铬中毒;纳米硒;肉鸡;ACACA基因;CPT1A基因

    中图分类号：S859.8? ? ? ? 文献标识码：A? ? ? ? 文章编号：1007-273X（2019）05-0010-02

    铬是一种微量元素，常见的价态为+2、+3、+6，三价铬是对人体有益的微量元素，六价铬的毒性较强.一般认为六价铬毒性是三价铬的1 000倍，Cr（VI） 还具有强氧化性和腐蚀性，因此，铬的毒性研究主要集中在Cr（VI）化合物上[1].目前为止，人们在铬中毒上的研究都是在大鼠，小鼠上[2]，肉鸡铬中毒研究几乎空白，肉鸡铬中毒的预防和治疗方法较少，所以我们对此进行了研究。已知纳米硒是一种新型材料，对于预防重金属中毒有重要作用，早期在动物的基础日粮中添加诸如Na2SeO4、Na2SeO3等无机硒，这一补硒方式有很多明显缺点，如转化率低，对环境有害等，当前已经有部分国家禁止无机硒作为补充剂来直接使用，而广泛使用有机硒[3-6]。铬也是一种重金属，因此用纳米硒去预防和治疗肉鸡铬中毒是可行的。

    肉鸡铬中毒之后，通过高通量测序，检测到ACACA和CPT1A这两个基因表达量变化较大，ACACA是一个上调基因，CPT1A是一个下调基因。本试验主要是采用纳米硒治疗铬中毒肉鸡，通过HE染色和RT-qPCR观察ACACA和CPT1A基因上调下调情况，以此来验证纳米硒对肉鸡铬中毒是否有预防、治疗和保护作用。

    1? 材料与方法

    1.1? 材料

    一日龄肉鸡（购于宜昌正大畜牧武汉分公司）;重铬酸钾（化学式：K2Cr2O7;分子质量：294.19;基准级，天津天灏化工厂生产，含量99.8%以上）;纳米硒（含量99.99%以上，200目，平均粒径40 nm）;伊红染色液;苏木素染液;10%福尔马林溶液; RNA提取、反转录试剂盒（武汉谷歌生物公司）;初级兔单克隆抗ACACA和CPT1A抗体（武汉AB克隆技术公司）。

    1.2? 方法

    急性试验：选取健康雏鸡20只适应性喂养6 d后，随机分为A、B、C、D 4组，每组5只。依照预试验中确定的雏鸡致死浓度范围，按Horn氏法设计 K2Cr2O7剂量如下：0.100、0.464、1.000和2.150 g/kg体重。经口灌胃染毒，灌胃容积按照各自雏鸡体重的1%计算，灌胃前将试验用雏鸡禁食6 h，饮水不限，观察14 d。根据Horn表计算得出K2Cr2O7对雏鸡的半数致死量（LD50）为0.464 g/kg体重，95%可信限为2.98～7.23[7，8]。

    1.3? 造模

    180只AA一日龄雏鸡，饲养1周之后分为6组：空白对照组（基础日粮和清水）、铬中毒组[0.037 g/（kg·d）的K2Cr2O7）、纳米硒对照组（基础日粮和0.5 mg/（kg·d）的纳米硒]、纳米硒保护组[0.037 g/（kg·d）的K2Cr2O7和0.5 mg/（kg·d）纳米硒同时饲喂]、纳米硒治疗组[饲喂2周0.037 g/（kg·d）的K2Cr2O7之后加入0.5 mg/（kg·d）纳米硒饲喂]、纳米硒预防组[饲喂2周 0.5 mg/（kg·d）纳米硒后再加入0.037 g/（kg·d）的K2Cr2O7饲喂]。试验鸡采用舍内笼养，自由采食饮水。育雏时温度控制在34 ℃左右，然后每周控制温度下降2～3 ℃直至恒温，直到试验结束[9，10]。

    1.4? HE染色

    35 d之后，处死肉鸡，按照试验要求取肝脏，用生理盐水清洗，然后迅速放入4%多聚甲醛固定液中固定，24 h后进行组织蜡块制作。

    1.5? RT-qPCR

    根据试验要求提取总RNA，然后电泳检测RNA的稳定性.之后进行反转录，再根据NCBI主页GeneBank已公布的目的基因序列，应用Primer premier 5.0软件设计引物，同時参考文献中提及的引物序列。引物设计见表1。之后进行实时荧光定量PCR，荧光定量体系见表2。

    2? 结果与分析

    2.1? 生长特征观察

    在整个试验过程中，空白对照组和纳米硒对照组鸡的行为特征，体重以及剖检病变无异常;铬中毒组鸡的精神不佳，体型偏小，被毛粗乱无光泽;添加纳米硒组鸡比铬中毒组鸡体型稍大，体重增加，精神状态良好。试验过程中无试验动物死亡。

    2.2? 病理切片观察

    肉鸡肝脏组织病理切片见图1。图1a和图1f为空白对照组和纳米硒对照组，可见其细胞膜、细胞核清晰，肝窦隙均正常;图1b为铬中毒组的肝脏切片，可见其细胞破裂，轮廓不清晰，细胞核破裂，核固缩，肝窦间隙增大，中央静脉管扩张;图1c为纳米硒保护组的肝脏切片，可见其一部分肝细胞处于正常状态，小部分被破坏;纳米硒治疗组（图1d）和纳米硒预防组（图1e）肝细胞比铬中毒组的肝细胞状态好。

    2.3? Rt-qPCR

    图2显示了35 d肉鸡肝细胞内ACACA基因的相对表达水平。与空白对照组比较，铬中毒组的ACACA基团表达水平显著升高（P<0.01）。与铬中毒组相比，纳米硒对照组、纳米硒保护组、纳米硒治疗组及纳米硒预防组的肝脏样本中的ACACA基因相对表达水平显著下调（P<0.05）。

    图3显示了35 d肉鸡肝脏的CPT1A基因相对表达水平。与空白对照组相比，铬中毒组CPT1A基因相对表达水平显著降低（P<0.01）。与铬中毒组相比，添加纳米硒的4个组CPT1A 相对表达水平均显著上调（P<0.05）。

    3? 讨论

    通过纳米硒预防和治疗肉鸡铬中毒试验可知，使用纳米硒添加剂之后，肉鸡的体重、毛色、肝脏病理状态都有所好转;ACACA和CPT1A两个基因的表达水平比铬中毒状态下的改变幅度降低。由此可知，纳米硒对肉鸡铬中毒有预防和保护作用，该结论可为今后研究肉鸡铬中毒的机理提供参考。

    参考文献：

    [1] KIMURA T.Molecular mechanism involved in chromium（VI） toxicity[J].Yakugaku? zasshi，2007，127（12）：1957-1965.

    [2] ZHU? Q.How is our body detoxified[J].Biological bulletin，2013， 48（7）：13-19.

    [3] ANAD S S. Protective effect of vitamin B6 in chromium-induced oxidative stress in liver[J].Journal of applied toxicology，2005，25：440-443.

    [4] 王胜男.六价络对鸡肝功能和抗氧化性能的影晌[D].山东泰安：山东农业大学，2015.

    [5] 王? 洋.硒对六价铬鸡中毒肝损伤的影响研究[D].山东泰安：山东农业大学，2017.

    [6] XUETING L，REHMAN M U，MEHMOOD K，et al. Ameliorative effects of nano-elemental selenium against hexavalent chromium induced apoptosis in broiler liver[J].Environmental science and pollution research，2018，25（16）：15609-15615.

    [7] 楊芝华，考庆君.三价铬和六价铬小鼠急性毒性及致突变性研究[J].浙江预防医学，2011，23（1）：17-21.

    [8] 李桂影.铬中毒的临床反应和实验研究[J].医学地理分册，2002， 23（1）：33-35.

    [9] HAO P，ZHU Y，WANG S et al. Selenium administration alleviates toxicity of chromium（VI） in the chicken brain[J].Biological trace element research，2017，178：127-135.

    [10] SAWICKA E，REDNICKA D，DUGOSZ A. Scutellaria baicalensis inhibits lipid peroxidation caused by chromium in human erythrocytes[J].Advances in clinical & experimental medicine，2008，15（5）：435.