乳品中兽药残留荧光检测技术的应用进展
方芳 郑君杰 孙志伟 李蓉蓉 刘薇 杨柳
近年来，乳品质量安全事件频发严重威胁着社会公共健康，故成为国际关注的重点。兽药残留是乳品质量管控的重中之重，因为其将直接危害消费者的身体健康。本文介绍了乳品中兽药残留的种类和危害，总结了荧光检测技术在乳品兽药残留检测中的应用，并展望了荧光检测技术在乳品兽药残留检测领域中的发展前景。
乳及乳制品作为一类营养全面的理想食品，能够为人体提供优质的蛋白质、脂肪、碳水化合物、维生素和无机盐等基本营养素。此外，乳制品在人类膳食结构中占有十分重要的地位，尤其是婴幼儿和老人。随着全球经济一体化和食品贸易国际化进程的加快，乳品的质量安全已成为世界性的挑战和全球关注的公共卫生问题。其中，兽药残留问题是影响乳制品安全的重要因素之一。目前，乳品中兽药残留的主要检测方法有微生物检测法、免疫分析法、仪器分析法、适配体传染器检测法等。本文就乳品中兽药残留的种类和危害进行简单介绍，并重点总结了荧光免疫分析技术在乳品兽药残留检测中的应用。
1 乳品中兽药残留的危害
兽药残留是指动物产品中任何可食部分所含兽药的母体化合物及（或）其代谢物，以及与兽药有关的杂质。所以，兽药残留既包括原药，也包括药物在动物体内的代谢产物和兽药生产中所伴生的杂质。按照用途，可将残留毒理学意义较大的兽药分为7类，包括：抗生素类、驱肠虫药类、生长促进剂类、抗原虫药类、灭锥虫药类、镇静剂类、β-肾上腺素能受体阻断剂类，其中抗生素类是最主要的兽药添加剂，约占药物添加剂的60%。
人体长期摄入含兽药残留的乳品后会造成药物积累，产生耐药性和毒害作用，破坏胃肠道菌群环境。乳品中残留的许多低剂量抗菌药物如青霉素、四环素类、磺胺类和氨基糖苷类等可使部分人群发生过敏反应，甚至休克;硝基呋喃类、雌激素等都已经被证明具有致癌作用;苯丙咪唑类抗蠕虫药具有潜在的致突变性和致畸性;磺胺二甲嘧啶会诱发动物甲状腺增生，并有致肿瘤倾向。长期食用含以上药物残留的乳品后，均可能产生致畸、致癌和致突变等“三致”作用。另外，生长激素、性激素、甲状腺素类促生长激素以及人工合成的蛋白质同化激素等会干扰人体内的激素平衡，产生一系列激素样作用。动物养殖生产中滥用兽药、药物添加剂会导致动物的排泄物、动物产品加工的废弃物污染生态环境，影响人类健康。因此，乳品中兽药残留的快速检测受到越来越多的重视。
2 荧光免疫分析技术
2.1 原理
1941年，Coons和Kaplan将荧光素和抗体结合来定位组织中的抗原，从而提出了荧光免疫分析法（fluorescent immunoassay， FIA）。该技术用已标记了荧光标记物的荧光抗体（抗原）作为探针，进而檢查组织或细胞内相应的抗原（抗体），并在组织或细胞中所形成的抗原-抗体复合物上沉着有荧光标记物。在荧光显微镜下观察样品，荧光标记物受激发光的照射而发出荧光，因此可以根据荧光所在的细胞或组织，实现对抗原或抗体的定位，同时还可利用定量技术对样本进行定量。
2.2 荧光标记物
2.2.1 荧光素
荧光素是指具有荧光特性的有机染料，Coons等首次报道了异氰酸荧光素标记抗体用于检测鼠组织切片中肺炎球菌抗原分布的研究。此后，Riggs等合成了性质稳定、毒性较低的异硫氰酸荧光素;Marshall等改良了荧光抗体标记技术，使荧光免疫技术得到快速发展。目前，应用于荧光免疫分析的荧光素主要有5种——异硫氰酸荧光素、四乙烯基罗丹明、四甲基异硫氰酸罗丹明、与酶作用后产生荧光的物质和镧系。
2.2.2 半导体量子点
半导体量子点纳米晶，简称量子点（quantum dots， QDs），直径通常在1～20nm之间，一般由II-VI或III-V族元素组成，具有激发谱宽、发射谱窄、荧光性强、不易淬灭、颜色可调等优点，是目前认为最具潜力的荧光探针之一。
2.2.3 稀土离子配合物
稀土离子配合物是指从元素镧到元素镥的15种元素的配合物，应用最广泛的主要是铕（Eu）和铽（Tb）。以钒酸盐（YVO4）为基质的纳米稀土发光材料是比较具有研究意义及应用价值的稀土荧光材料，由于其固态的微环境，掺杂矾酸盐的稀土离子配合物可增强其稳定性，避免了溶剂分子对荧光的淬灭，从而可发出高强度的特征荧光。随着纳米科学技术的发展，这一荧光材料有望成为新的免疫荧光标记体。
2.2.4 上转换纳米粒子
Auzel于1966年在研究NaYb（WO4）2钠玻璃时发现，如基质中含有Yb3+时，Er3+、Tm3+等，在近红外光激发下可以发射出可见光，由此提出了上转换发光的概念，即激发光的能量比发射光的能量低，称之为上转换发光。上转换发光大都发生在掺杂稀土离子的化合物中，NaYF4是目前上转换发光效率最高的基质材料。上转换纳米粒子与荧光染料、量子点相比具有毒性低、灵敏度高、稳定性好的优点，可避免样品中荧光特性基质对检测结果的影响，是目前理想的荧光标记物之一。
3 荧光免疫分析技术分类及其在乳品中兽药残留检测中的应用
3.1 荧光偏振免疫分析
荧光偏振免疫分析技术是以免疫竞争原理和荧光偏振原理为基础的一种快速筛选分析技术，主要用于测定小分子量物质（抗原），即检测荧光标记抗原在结合特异性抗体前后的荧光偏振值变化，是均相的竞争免疫分析方法。这一反应系统完全在溶液中进行，不需要分离抗体，不易受到溶液颜色、仪器灵敏度的影响，具有操作简单和检测时间短等优点，适用于大量样本的快速筛选。
高月建立了用于检测牛奶中新霉素残留的荧光偏振检测方法，回收率高达87.91%～114.28%。宋佩等以异硫氰酸荧光素（FITC）作为荧光标记物标记沙拉沙星，利用薄层色谱法提纯，建立了沙拉沙星的快速荧光偏振免疫分析法。沙拉沙星在缓冲液中的半数抑制浓度（IC50）为43.2mg/L，检测范围为5.7～327mg/L，达到了国家规定的动物性食品中兽药最高残留限量（80mg/kg）的要求，与环丙沙星、恩诺沙星、加替沙星及氧氟沙星的交叉反应率分别为3.3%、1.8%、1.7%和0.7%，牛奶中沙拉沙星的回收率在71%～94%之间。该方法操作便捷、灵敏度高、特异性强，适用于动物性食品中沙拉沙星残留的快速筛选检测。
3.2 时间分辨荧光免疫分析
时间分辨荧光免疫分析采用镧系稀土元素，如铕（Eu3+）螯合物标记抗原或抗体，螯合物经激发后可发射特征荧光，通过时间延迟和波长分辨进行检测，使强特异性荧光和背景干扰荧光区分开，有效地排除了干扰因素，提高了分析方法的灵敏度。
Leivo等应用TRF结合荧光免疫法对牛奶中的氟喹诺酮进行检测，其线性范围为0.2～68.0μg/L，并指出这种检测方法可以进一步优化以实现各种牛奶样品中氟喹诺酮的检测。高文慧等构建了Eu3+-苯甲酸（BA）-邻菲啰啉（Phen）三元配合物体系荧光探针，检测牛奶中盐酸四环素残留，其线性范围为1.0×10-6～5.0×10-5mol/L，且具有较好的选择性和较高的回收率。Bacigalupo等通过建立间接竞争TRFIA对牛奶中的氨苄青霉素进行定量分析，灵敏度明显高于ELISA，远超欧盟标准。
3.3 量子点荧光免疫分析
以量子点作为荧光标记探针开发的荧光免疫分析方法，可利用其高强度的荧光信号，大幅度提高兽药残留的检测灵敏度。量子点荧光分析法具有快速、准确、灵敏以及优越的重现性，目前应用和研究愈发广泛。
李研东等通过制备量子点标记抗体，建立了四环素类药物残留量子点荧光免疫分析方法。结果显示，50%抑制浓度（IC50）为0.9μg/L;四环素、金霉素、土霉素的交叉反应率分别为100.0%、154.0%和46.4%;四环素、金霉素、土霉素的最低检出限分别为3.0μg/kg、2.0μg/kg和6.0μg/kg，样本添加回收率在78.7%～97.0%，批内、批间变异系数<15%。国家兽药安全评价中心于2007年建立了牛奶和猪肉中磺胺二甲嘧啶的直接竞争荧光免疫分析法，其中牛奶50%的抑制率（IC50）为4.3ng/mL，检测限为0.6ng/mL，此方法的回收率在94.0%～106.2%。Li等通过多残留荧光微球免疫层分析法对生乳中的红霉素、螺旋霉素、替米考星和泰乐菌素同时进行检测，结果显示，半抑制浓度（IC50）值分别为1.36ng/mL、1.22ng/mL、1.01ng/mL和1.39ng/mL，检测限（LOD）为0.13ng/mL，回收率范围分别为91.8%～109.2%、89.6%～114.4%、84.8%～111.6%和85.8%～115.2%。该方法大大简化了操作步骤，整个测试过程在20min内完成，节省了大量时间。
3.4 上转换纳米粒子荧光免疫分析
HU等人将NaYF4：Yb/Tm上轉换纳米粒子标记抗体结合物作为荧光探针，单分散磁性聚苯乙烯微球标记抗原结合物作为免疫信号捕获探针，用于检测牛奶样本中的SQX。标准缓冲液SQX的LOD为0.1μg/L，样本中为0.5μg/L，标曲线性范围为0.1～100μg/L。样本中添加回收率为69.8%～133%，变异率为0.24%～25.06%。该方法无需前处理，可直接稀释测定，便于现场大批量检测。
王瑜等以上转换纳米粒子结合己烯雌酚单克隆抗体作为荧光探针，建立了上转换免疫层析荧光快速定量检测己烯雌酚残留方法。该试纸条线性范围为25～1000ng/mL，检出限为20.84ng/mL，批内、批间变异系数小于10%，牛奶样品的添加回收率为90.1%～115.2%，相对标准偏差小于5%，为牛奶中己烯雌酚残留快速定量检测提供了新的测定方法。
刘晓等以上转换发光材料为标记物，建立了可对奶制品中黄曲霉毒素M1进行现场快速检测的上转换荧光免疫层析方法。该方法对奶粉和牛奶中黄曲霉毒素M1的检测灵敏度分别达到0.1ng/mL和0.3ng/mL，每个浓度重复测量的变异系数小于15%。
3.5 荧光猝灭免疫分析
荧光淬灭免疫分析法是指荧光物质分子与溶剂分子或溶质分子之间所发生的导致荧光强度降低的物理或化学作用的过程，与荧光物质分子相互作用引起荧光强度降低的物质称为荧光猝灭剂。胡高爽等依据荧光共振能量转移的原理，建立了一种新型免疫标记荧光猝灭试纸条检测牛奶中兽药磺胺喹恶啉（sulfaquinoxaline，SQX）的残留。该免疫荧光猝灭试纸条检测SQX的方法检测限为1μg/L，牛奶样品的检测限为8μg/L，且该方法操作简便、灵敏度高、检测时间短、结果易于判断，可以用于牛奶中SQX残留的现场快速检测。
3.6 荧光免疫层析分析
荧光免疫层析技术是基于抗原抗体特异性免疫反应的新型膜检测技术，其以固定有检测线和质控线的条状纤维层析材料为固定相，测试液为流动相，荧光标记体或抗原固定于连接垫，通过毛细管作用使待分析物在层析条上移动。该方法具有灵敏度高、稳定性好、受自然荧光本底干扰低等优点，是快速检测分析研究的热点。
Taranova等将具有不同发射波长的量子点偶联氯霉素抗体、链霉素抗体、氧氟沙星抗体为荧光探针，构建了可同时检测牛奶中3种抗生素的荧光免疫层析试纸条，该试纸条对氧氟沙星的检测限为0.3ng/mL，氯霉素的检测限为0.12ng/mL，链霉素的检测限为0.2ng/mL，比使用同一对应抗体建立ELISA方法的检测限低80～200倍，对实际牛奶样品的添加回收率为92%～101%。
4 展望
随着科学技术的日益提高，兽药残留检测技术的水平也在逐步提升。在乳品兽药残留的检测分析中，目前较为常用的仪器分析法、免疫分析法的灵敏度有了显著提高。相较于仪器分析和常用免疫分析的检测方法，荧光免疫分析技术由于灵敏度高、特异性强、体积小、操作简单、成本低等诸多优势受到科研工作者的广泛关注，但是也存在一些问题，需要科研工作者逐步进行完善。如开发、探索化学性能好，发光性能优良，在进一步提高检测结果准确度和灵敏度方面有极大潜能的新型标记物用于抗原抗体的标记等问题。
相信随着荧光免疫分析技术的不断完善，以及自身优势的凸显，其在乳品兽药残留检测领域中将得到更广泛的应用。
