温带臭虫细胞色素P450 CYP4C1蛋白生物信息学分析
雷廷 李敏 李荣荣 程璟侠
摘 要：为阐明CYP4家族基因在温带臭虫（Cimex lectularius）解毒代谢机制中的作用，应用生物信息学软件对温带臭虫CYP4C1蛋白的结构与生物学特性进行预测和分析。通过GenBank数据库获得温带臭虫CYP4C1基因与CYP4C1蛋白序列信息，利用生物信息学软件对CYP4C1基因、CYP4C1蛋白进行分析;并构建系统发育树。结果表明，温带臭虫CYP4C1的cDNA编码区全长为1053bp，编码500个氨基酸;第5～23位氨基酸为疏水区;不稳定指数为37.85;在5～27位氨基酸之间形成1个典型的跨膜区;无信号肽结构;亚细胞定位在细胞质中;具19个磷酸化位点，3个糖基化位点以及4个N-酰基化位点;二级结构预测显示，主要结构元件为α-螺旋和无规卷曲;含3个二硫键;含P450结构功能域。
关键词：温带臭虫;CYP4C1蛋白;结构;功能;生物信息学
中图分类号 R384文献标识码 A文章编号 1007-7731（2021）07-0018-06
Bioinformatics Analysis of CYP4C1 Protein in Cytochrome P450 of Cimex lectularius
LEI Ting1 et al.
（1Department of Biology， Taiyuan Normal University， Jinzhong 030031， China）
Abstract： To illuminate the foundation for elucidating the role of CYP4 family genes in the detoxification and metabolism of Cimex lectularius， bioinformatic softwares were applied to predict and analyze the structure and biological characteristics of the CYP4C1 protein. The sequence information was obtained from GenBank database. CYP4C1 and CYP4C1 protein were analyzed by bioinformatics software. And the phylogenetic tree was conducted. The results showed that the full-length of CYP4C1 cDNA is 1053 bp long， encoding 500 amino acids; the predicted hydrophobic region is 5-23 and the instability index is 37.85; the transmembrane region is 5 to 27; it has no signal peptides and the subcellular localization analysis indicates it exists in cytoplasm; .it contains 19 phosphorylation site， 3 glycosylation sites and 4 N-acylation sites; its secondary structure is composed mainly of α-helix and random coil; protein domain prediction shows that it contains the P450s structural domain.
Key words： Cimex lectularius; CYP4C1 protein; Structure; Function; Bioinformatics
温带臭虫（Cimex lectularius）是隶属于半翅目（Hemiptera）臭虫科（Cimicidae）臭虫属（Cimex）的一类无翅昆虫，与人类密切相关，主要靠吸食人血为生，昼伏夜出，叮咬人体的皮肤后，可以致使部分皮肤受到损伤，出现红肿、瘙痒等症状，部分人可能发生激烈的过敏反应，严重者会出现丘疹样荨麻疹[1]。温带臭虫在全世界范围内均有分布，近十几年来，温带臭虫在欧洲、北美、澳大利亚和亚洲等部分发达国家和地区重新出现[2-4]。我国部分地区，温带臭虫也日趋常见，有广泛发生的风险[5]。现阶段，臭虫防治的主要方法是喷洒化学杀虫剂，然而随着杀虫剂的大量应用，大多数臭虫对不同的杀虫剂有了明显的抗性[6-7]，使得臭蟲的防治进入新阶段。
细胞色素P450（cytochrome P450，CYP）酶系由多个基因家族组成，广泛分布于动物、植物和微生物等生物体不同的细胞和组织中，是一类末端加氧酶，参与生物体内源性有害物质以及杀虫剂等外源性有害物质的代谢，在昆虫中主要与内质网和线粒体相结合发挥作用。近年来，细胞色素P450的结构和功能研究取得很大的进展，尤其是其在药物代谢中发挥的作用。在昆虫抗性种群中，P450基因显著过量表达，提示其发挥的代谢解毒作用是昆虫产生抗药性的重要机制之一，一般认为CYP6家族成员与昆虫抗杀虫剂的能力关系最为密切[8-10]。但近年来报道，在具抗药性的昆虫体内，CYP4家族的基因过量表达，表明CYP4家族在昆虫的解毒代谢中也发挥重要作用[11-12]。
本研究通过生物信息学软件分析方法对温带臭虫基因组CYP4C1及CYP4C1蛋白的结构和生物学特性进行预测分析，旨在为进一步从分子水平研究温带臭虫细胞色素P450基因功能奠定基础，以期为温带臭虫的综合防治提供新思路。
1 材料与方法
1.1 数据来源 温带臭虫CYP4C1基因序列及其编码的蛋白质序列来自美国国立生物技术信息中心（NCBI）GenBank数据库。基因序列CYP4C1登录号为XM_014386381.2，蛋白序列CYP4C1登录号为XP_014241867.1。将蛋白序列在NCBI中做Protein BLAST（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）在线比对，选取Swiss-port数据库进行比对，算法采用blastp（protein-protein BLAST），以确定CYP4C1蛋白序列的正确性。
1.2 CYP4C1基因序列分析 利用NCBI网站的在线预测工具ORF Finder（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/gorf/）对基因的开放阅读框进行分析;使用BioEdit v7.2.5对核酸序列组分进行分析;使用CodonW1-4-2软件分析密码子使用率。
1.3 CYP4C1蛋白质序列分析 分别使用ExPASy的ProtParam tool（https：//web.expasy.org/protparam/）和ProtScale（http：//www.expasy.org/cgi-bin/protscale.pl）进行蛋白质序列的理化性质、亲疏水性分析;采用TMHMM Server v. 2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）对蛋白质序列的跨膜区进行预测;使用SignalP 5.0 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）预测蛋白质的信号肽;利用TargetP 2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/）对蛋白亚细胞定位进行预测;使用ExPASy中的ScanProsite（https：//prosite.expasy.org/）对蛋白质翻译后修饰位点进行预测;用SOPMA（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html）在线预测工具预测其编码蛋白的二级结构;使用Scratch Protein Predictor（http：//scratch.proteomics.ics.uci.edu/）中的DIpro预测二硫键的位置;运用SMART（http：//smart.embl-heidelberg.de/）分析蛋白质的结构功能域;利用SWISS-MODEL（http：//www.expasy.ch/swissmod/SWISS-MODEL.html）對蛋白质进行同源建模，预测出蛋白质的三级结构。
1.4 系统发育分析 选取相似率大于45%的半翅目昆虫CYP4C蛋白序列，以黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）CYP4C3蛋白序列为外群，使用MEGA X软件采用邻接法（Neighbor-joining method，NJ）构建系统发育树，替换模型为p-distance，位点进化速率为Gamma distributed，1000次重复计算bootstrap（BP）值（表1）。
2 结果与分析
2.1 CYP4C1基因序列分析 从GenBank数据库中获得温带臭虫CYP4C1基因的cDNA序列，登录号为XM_014386381.2，长度为1712bp。经ORF Finder在线工具分析，最长的开放阅读框为1503bp，编码500个氨基酸（图1）。编码区核酸序列组分分析结果显示分子质量是455.6kDa（单链状态）909.9kDa（双链状态），GC含量为35.06%，AT含量为64.94%。
2.2 CYP4C1基因密码子使用相对概率 密码子使用相对概率（RSCU）值反映密码子在所编码的氨基酸的同义密码子中出现的频率。结果显示CYP4C1共含有501个密码子，4种密码子使用最普遍，依次为AAA-Lys、GAA-Glu、AUU-Ile和UUU-Phe，其中3种均由A或T组成。3种最主要的氨基酸分别为Leu（61）、Ile（45）和Lys（40）。
2.3 CYP4C1蛋白基本理化性质 根据CYP4C1蛋白在BLAST中比对结果，显示其确定为CYP4C1蛋白。ProtParam软件分析表明，CYP4C1编码的蛋白的分子式为C2656H4152N668O735S20，理论相对分子质量为57.8kDa，理论等电点为8.43，不稳定指数为37.85，根据Guruprasad方法表明CYP4C1蛋白为稳定蛋白[13]。脂肪指数为98.84。在组成该蛋白的20种氨基酸中，亮氨酸（Leu）所占的比例最高，为12.2%，色氨酸（Trp）含量最低，为0.8%。CYP4C1蛋白含有56个带负电荷的氨基酸残基，60个带正电荷的残基。
2.4 亲疏水性 ProtScale在线分析蛋白质的亲疏水性（图2），在N端5-23位氨基酸之间为疏水性区域，且在第12位氨基酸疏水性达到最强，疏水指数为3.789，最低值-2.644出现在253位，平均疏水指数为-0.120，为亲水性蛋白。
2.5 跨膜区、信号肽及亚细胞定位 使用TMHMM Server v.2.0软件预测CYP4C1蛋白第5～27个氨基酸为跨膜区域（图3），表明该蛋白为跨膜蛋白。使用SignalP 5.0 Server进行信号肽预测，显示该蛋白质无信号肽（图4）。运用TargetP 2.0 Server进行的亚细胞定位预测表明，CYP4C1蛋白定位在细胞质。
2.6 翻译后修饰位点 使用ScanProsite对翻译后修饰位点结果预测显示，CYP4C1蛋白存在11个蛋白激酶C磷酸位点，7个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸位点，1个酪氨酸激酶磷酸化位点，3个N-糖基化位点以及4个N-酰基化位点（表3）。
2.7 蛋白质二级结构 利用SOPMA在线预测温带臭虫CYP4C1蛋白的二级结构，结果表明：α–螺旋占比最大，占比为49%，无规卷曲占比为35.8%，β–转角占比为3.4%，延伸链占比为11.8%（图5）。使用DIpro预测蛋白质二硫键的数量及形成位置（表4）。
2.8 结构功能域 使用SMART进行结构功能域分析显示CYP4C1蛋白34～495位之间含高度保守的P450结构功能域，包括5个保守结构域，分别为WxxxR，A/GGxE/DTT/S，ExxR，PxxFxPE/DRF和FxxGxxxCxG。温带臭虫CYP4C1蛋白中，A/GGxE/DTT/S的第1个氨基酸被谷氨酸（E）所代替;PxxFxPE/DRF的第6个、第8个和第9个氨基酸分别被苏氨酸（T）、谷氨酸（E）和丙氨酸（A）所代替（图1）。
2.9 蛋白质三级结构 通过SWISS-MODEL同源建模预测CYP4C1蛋白的三级结构（图6），模板序列与预测序列的模型相似度为32.25%，对模型进行评估的GMQE为0.66，表明预测所得的三级结构是可靠的。
2.10 系统发育分析 选择温带臭虫和其它16种半翅目昆虫的CYP4C同源序列，以黑腹果蝇作为外群，构建系统发育树（图7），结果显示温带臭虫Cl CYP4C1与红猎蝽属物种Rhodnius neglectus Rn CYP4C3关系较近，bootstrap值为85%。其余端部分支bootstrap值均为100%。
3 结论与讨论
细胞色素P450是一个可自身氧化的亚铁血红素蛋白超家族，广泛表达于产生抗药性的昆虫品系中，证实是昆虫产生抗药性的原因之一[14]。昆虫的CYP蛋白质的分子量大多位于55～65kD之间[15-16，17]，本研究中，温带臭虫CYP4C1基因编码区包含1503bp，编码500个氨基酸，分子量为57.8kD，位于上述范围内。软件ProtParam tool、TMHMM Server v.2.0和SOPMA预测温带臭虫CYP4C1蛋白第5～23/5～27位氨基酸为疏水/跨膜区，且主要由α-螺旋组成，这与蛋白质的跨膜区一般是由疏水性氨基酸组成的α-螺旋一致[18]，推测CYP4C1蛋白在与磷脂层锚定结合上起到重要的作用。细胞色素P450主要定位于内质网和线粒体膜上，亚细胞定位显示该蛋白位于细胞质中，细胞质包括细胞质基质、细胞器和内含物，但该蛋白定位仍需进一步研究。
二硫键（S-S）是蛋白质结构中比较稳定的共价键，起着稳定肽链空间结构的作用，本研究预测温带臭虫CYP4C1蛋白含3个二硫键，表明该蛋白质分子对抗外界压力的稳定性较高。在生物体内有功能的蛋白质通常在翻译结束后要经过多次位点修饰。有研究表明，蛋白质的磷酸化与去磷酸化過程在细胞信号转导中起重要作用，如基因的表达、糖代谢、细胞生存周期等生命活动[19-20]。本研究中，ScanProsite分析温带臭虫CYP4C1蛋白翻译后修饰位点，该蛋白含有11个蛋白激酶C磷酸位点，7个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸位点和1个酪氨酸激酶磷酸化位点，说明其可能受到蛋白磷酸激酶的调控。
CYP4C1蛋白含有P450家族共有的保守结构域：WxxxR，A/GGxE/DTT/S，ExxR，PxxFxPE/DRF和FxxGxxxCxG[21]，与SMART预测的34～495位之间含高度保守的P450结构功能域一致，但温带臭虫CYP4C1蛋白中，A/GGxE/DTT/S的第1个氨基酸被谷氨酸（E）所代替;PxxFxPE/DRF的第6个、第8个和第9个氨基酸分别被苏氨酸（T）、谷氨酸（E）和丙氨酸（A）所代替，这可能与不同物种有关。
温带臭虫CYP4C1与红猎蝽属物种Rhodnius neglectus CYP4C3的一致率和相似率最高，分别为48.7%和67.3%，在基于邻接法构建的系统发育树中，两者也聚为一支，且bootstrap值为85%，这或许与两者都具吸血习性有关。
本研究基于多种生物信息学软件，全面分析了温带臭虫CYP4C1蛋白序列特征，预测了蛋白功能，构建了系统发育树，为温带臭虫的杀虫剂抗性分子机制研究提供了一定的理论依据。
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（责编：王慧晴）
