激光剥蚀原位有机碳稳定同位素分析方法
张晗 魏来 廖旭 王佳妮 史秋月 张娴
摘 要 自行研制了激光剝蚀取样与稳定同位素质谱联用接口，建立了以激光剥蚀微量取样的微区有机碳同位素分析方法。考察了捕集时间、样品量和激光能量等对同位素分馏的影响，采用3种标样验证了分析方法的准确性。结果表明，此装置可对固体样品进行高灵敏度的连续在线分析，样品用量仅10?8 g，比传统的元素分析同位素质谱联用方法的样品用量降低了104倍。本方法有效避免了激光剥蚀在取样、传输和离子化过程的多种分馏因素，获得了可重复的、高精度的测试结果。以13C标记的水稻为例，在叶尖获得了横截面的碳同位素分布差异信息。结合激光剥蚀技术原位取样的优势，此技术可用于考察固体样品微区高分辨的碳同位素分布，在环境、农林学、生态学领域具有良好的应用前景。
关键词 激光剥蚀;有机碳稳定同位素;原位碳同位素分析
1 引 言
激光剥蚀（Laser ablation）显微取样技术是地球、环境和考古科学研究中重要的分析工具[1]。 该技术样品用量少，制样简单，可远程、实时、在线，相对快速地处理、提取样品，并具备高空间分辨率能力，可将101～102 μm深度的测量剖面划分成不同区域，以描述其生长带或扩散梯度空间，具有相当大的分析灵活性。激光剥蚀用于电感耦合等离子质谱（ICP-MS）分析的技术已经很成熟，是高灵敏度、多元素微区微量原位快速分析技术。将激光烧蚀显微取样方式与气体同位素质谱联用（Laser ablation-isotope ratio mass spectrometry，LA-IRMS）一方面可快速地将固体样品直接引入同位素质谱，避免离线制样的种种困难，减免气体交换风险，提高取样的准确度和进样效率;另一方面可充分利用激光烧蚀微区原位取样优势，取样量低，分析时间短，可获得包含固体样品空间信息的二维同位素分布图像。
目前已有一些相关文献报道，如Moran等[2]采用LSX-500Nd：YAG激光，以266 nm波长输出，烧蚀固体样品表面，设计了圆形不锈钢剥蚀腔体，剥蚀后的样品通过催化燃烧后，以六通阀门导入定量环，引入气体稳定同位素质谱。该技术成功将原来至少25 μg碳样品量降低至65 ng，后续成功应用该技术示踪了生物垫（Microbial mats）内不同类型藻类微生物群落对标记的碳酸盐的累积状况，实现了50 μm的空间分辨率[3]。2019年，该课题组又利用该技术研究了根系碳在土壤中的分配[4]。 van Roij等[5]于2017年设计的ng级激光烧蚀系统与同位素质谱联用，实现了对单花粉颗粒的激光取样同位素检测。该设备采用193 nm DUV（深紫外）ArF激光，设计了微量激光烧蚀腔体与气相色谱联用，实现了连续流多点位即时采样。最近，该研究组采用该技术对单个水蚤进行了多次采样（常规分析通常需要大于20只水蚤），并获得了良好的重现性[6]。2019年，Rodionov等[7]采用213 nm激光剥蚀与PreCon联用，研究了根系分泌物对土壤微生物影响，发现25%～50% 的根系碳在300 μm区域内与土壤/土壤微生物进行交换。
然而，目前相关研究仍存在因同位素质谱载气流速限制，为了完全吹扫样品而不得不限制样品池体积，以致样品池过小而应用受限的问题[5]，以及载气不纯或系统连接处微漏等因素累积导致空白背景信号过高[7]等缺陷。本研究对现有联用设备的缺陷进行了针对性改进，研制了通用性强、低背景的样品池，优化了接口设计和测试条件，实现了对固体样品原位、快速、微量、高精度有机碳同位素分析。
2 实验部分
2.1 仪器与试剂
UP-213激光剥蚀系统（New Wave公司）;Delta V advantage稳定同位素质谱仪、PreCon气体预浓缩系统（美国Thermo Fisher Scientific公司）。
自行研制的激光剥蚀与稳定同位素质谱联用接口包含： （1）复合吸附净化装置 由于激光剥蚀取样在纳克级别，干净的背景尤为重要。系统背景主要来源于两方面： 系统管路各接头和样品池的密闭性导致空气中CO2和其它含碳杂质进入;载气纯净度。由于采用冷阱富集，在富集样品的同时，载气中含碳杂质亦同时被累积。本套系统对载气采用分级净化，针对烃类杂质，在氦气管路增加烃类捕集阱（In-line gas purifiers，Agilent）;针对CO采用舒茨试剂（I2O5）捕集;针对CO2采用NaOH捕集，另加装Mg（ClO4）2除去痕微量剥蚀出的H2O，多重复合吸附剂共同作用，确保零背景信号。（2）样品池和样品台 简化样品池，除顶部石英玻片采用螺丝固定，其余为不锈钢抛光加工，一体成型，避免漏气。样品池直径30 mm，体积5.65 mL，远大于文献[3]样品池尺寸，适用范围更宽。商业化的激光剥蚀一般用于ICP-MS，流量高达1 L/min，而同位素质谱载气仅为1～2 mL/min。为了保证完整吹扫，样品池内壁为弧形设计，载气流量25 mL/min，在双冷阱处以六通阀切换至1 mL/min后进入质谱。（3）高温反应炉 由于剥蚀出的样品为有机气溶胶，需转化为CO2进入稳定同位素质谱。采用热电公司Precon内微量高温反应炉，在1000℃高温下，将剥蚀出的气溶胶定量转化为CO2。（4）双冷阱富集装置 由于样品传输存在先后，为完整收集剥蚀样品，对高温炉转化后的CO2采用冷阱捕集，并二次聚焦，确保完整反映样品真实信息，并减少样品间干扰。（5）反吹系统 为避免样品残存在样品池或传输管路，加装反吹载气，在样品采集后，开启反吹，自高温炉往回吹扫，经过反应池和化学吸附阱后排空。（6）水阱 在进入质谱离子源前加装半透膜水阱，以氦气吹扫，除去高温炉生成并从冷阱内逸出的少量水分。整套装置设计和实物如图1所示。
标准样品： IAEA-CH-7（聚乙烯塑料薄膜，国际原子能机构）;IAEA 600（粉末状半胱氨酸，国际原子能机构）;Urea（粉末状尿素，IVA Analysentechnik）。
2.2 实验方法
2.2.1 检出限和灵敏度计算方法 在激光剥蚀前加装三通，其中两通连接气路，一通采用橡胶隔垫密封，用于直接注射CO2，以计算装置的灵敏度，判断激光剥蚀的样品量和无激光剥蚀时整个系统的稳定性和准确性。连续8次注射1 μL CO2标准气，平均峰面积为83.25 Vs，根据气体摩尔体积公式计算，1 μL CO2气体中含有535.2 ng碳，即该套系统的灵敏度（碳）为6.4 ng/（V s）。 同时，Delta V advantage同位素质谱获得稳定测试结果要求信号在500 mV以上，对应体积约0.7 Vs，由此计算该套系统测试检测下限为～4.5 ng碳。
2.2.2 激光剥蚀原位有机碳同位素分析方法 （1）测试开始，将六通阀切换至Load模式，放下冷阱1至液氮。打开激光剥蚀，选好能量、光斑、剥蚀方式等参数，预热6 s后，开始剥蚀。（2）剥蚀时间通常延续5～20 s，富集过程通常持续50～100 s，确保剥蚀出的气溶胶样品被捕集完全，然后切换六通阀。（3）放下冷阱2，预冷5 s，同时打开反吹清扫样品池。（4）提起冷阱1，将富集的样品转移至冷阱2。（4） 提起冷阱2，将样品送入质谱测试。
3 结果与讨论
3.1 系统空白
经过多重净化材料吸附，背景信号被有效控制，冷阱富集载气50 s时，整体背景信号仅0.015 V s，远优于文献[6]（50 s富集后，背景近2.0 V s）。富集100 s时，背景也仅0.105 V s，完全满足测试需求。
3.2 剥蚀样品捕集条件测试
LA-ICPMS产生的分馏效应发生在激光与样品的相互作用过程、样品气溶胶颗粒的传输过程以及样品气溶胶在ICP等离子体中的离子化过程。将激光剥蚀应用于同位素测试时，该问题的解决同样至关重要。激光剥蚀的气溶胶颗粒能否代表样品的原始组成，是否产生质量歧视，能否传输完全，能否完全转化为CO2并在离子源中定量检测，是测试中需要考虑的因素。本研究对各过程影响因素进行了系统优化。
3.2.1 捕集时间 受同位素质谱灵敏度限制，实际采样根据样品含碳量确定剥蚀长度/面积，过程将持续数秒，
若实时采集，样品峰将严重拖尾。本套联用装置采用双冷阱富集，能够对每次剥蚀样品中不同形态、不同大小和先后传输的颗粒进行完整收集，有效避免因前述过程导致的质量歧视和同位素分馏，弥补了LA-ICPMS实时联用过程中剥蚀气溶胶和颗粒在传输和离子化过程带来的分馏缺陷。
以国际原子能机构提供的IAEA-CH-7聚乙烯塑料膜作为参考，确定冷阱捕集。在激光输出能量60%、激光光斑55 μm、激光线性剥蚀IAEA-CH-7长度300 μm条件下，（剥蚀出～150 ng碳），考察不同冷阱富集时间对可捕集到样品量的影响。由图2可见，冷阱富集50 s时，样品捕集基本完成。综合考虑空白背景影响和分析效率因素，选择样品捕集时间为50 s。
3.2.2 剥蚀样品量
对IAEA-CH-7聚乙烯塑料膜进行不同长度剥蚀，测试冷阱富集条件对样品量的容纳程度，如图3所示，冷阱捕集50 s条件下，剥蚀线性长度为50～500 μm（样品峰面积2.5～10.87 V s），与同位素质谱捕获的峰面积呈线性相关（R2=0.991），表明此冷阱富集条件对该信号范围内的样品峰可基本实现完全富集。
3.2.3 激光能量 由于IAEA-CH-7聚乙烯塑料膜形态相对特殊，相对薄而容易被击穿，在验证激光能量时，选择了常规EA-IRMS常用的粉末状标物IAEA 600（半胱氨酸）并对其压片后测试。压片后的样品厚度可控，形态如图4A所示。连续调整激光输出能量，
由20%调整至100%（20%以下无法剥蚀出足够样品），重复3次。激光能量对同位素比值的影响见图5，激光能量50%时，同位素比值趋于恒定。有研究表明[7]，激光能量密度需高于样品的剥蚀阈值，能量过低会产生严重的元素分馏效应。由图5可推测，激光能量50%时，方可对标准品进行完整剥离，获得稳定的、能够反应基体真实同位素比值的样品。研究结果也表明，激光能量密度亦影响气溶胶颗粒尺寸，低能量激光倾向形成小尺寸颗粒气溶胶，利于传输和离子化。综合考虑尺寸因素，规避分馏效应，选择在激光能量60%的输出条件下对样品进行剥蚀。
值得注意的是，文献[8]指出激光剥蚀光斑大小同样会影响元素的分馏效应，激光光斑越小，分馏因子越大，可能与激光剥蚀频率和剥蚀直径共同影响的剥蚀坑形状有关。本研究结果表明，激光光斑大小对稳定同位素比值存在显著影响，但在恒定光斑尺寸下，同位素比值恒定，可以认为此影响可作为整套设备的系统误差通过标准样品进行校正。
3.3 标准样品测试
在激光能量60%、光斑55 μm、冷阱捕集50 s、剥蚀线性长度300 μm条件下，对IAEA-CH-7和压片后的IAEA 600和实验室标准Urea重复测试，剥蚀痕迹電镜图见图4，平行样剥蚀尺寸、形状和深度基本可控。3种标准物质平均峰面积分别为6.7、10.7 和3.7 V s，标准偏差分别为0.15‰、0.07‰和0.18‰，精度满足测试要求。对标准品同时采用元素分析-同位素质谱测试（Element analyzer-isotope ratio mass spectrometry，EA-IRMS），结果见表1和图6。分别以两种测试结果与真值作图，3个标准品以EA-IRMS测试线性相关系数R2=1，而LA-IRMS方法测试的样品用量仅为元素分析方法样品用量的万分之一，线性相关系数R2=0.992。
另外，对IAEA 600在同一个剥蚀痕迹槽内重复剥蚀，以检验上一次剥蚀是否存在质量歧视，或是否导致基质同位素比值发生变化。选择两个点位，在每个点位连续重复剥蚀5次，均值分别为27.69±0.16和27.78±0.19，在误差范围内，可认为剥蚀过程并未产生同位素分馏。
3.4 同位素標记的水稻叶片微区测试
选择以13C标记的CO2培养的水稻叶片尖部，进行微区碳同位素分布测试（图4和图7）。在1 mm宽的叶尖横面，从右到左，依次间隔剥蚀取样8次，平行两次。剥蚀后的叶片电镜图和碳同位素测试结果如图7所示。每个取样点为55 μm直径的圆孔，同一叶片在相同培养条件下，不同区域对13C标记的CO2吸收效率不同，呈现中间和边缘贫化、两端富集的趋势。水稻叶片中心叶脉和叶片边缘处对标记的13CO2吸收相对较弱，而两边叶肉部分对13CO2 吸收较强，即叶肉部分光合作用和呼吸作用强于叶脉和叶缘。研究表明[9]，植物13CO2短期动态存在同种植物不同器官的差异，植物叶片呼吸释放CO2碳同位素组成有较大的差异，变化幅度大于树干/茎呼吸释放。本研究在叶肉，叶脉和叶缘微观尺度上研究植物呼吸释放CO2的行为差异，此差异细节有望为环境生态研究人员提供关于植物呼吸、营养吸收，光合作用等生态过程更详细的信息，使植物生长过程可视化。
4 结 论
将激光剥蚀取样技术与稳定同位素质谱联用，用于微区有机碳同位素测试。自行研制了激光剥蚀与同位素连用接口，定制了多重载气过滤装置和低流速微型样品池，以微量高温反应炉将剥蚀出的气溶胶在线转化为CO2，并采用双冷阱对转化后的CO2进行富集和聚焦。该套设备获得了超低空白信号，并有效避免了激光剥蚀技术在传输和离子化过程产生的分馏。分析样品量仅需数十纳克，为传统元素分析同位素质谱分析方法样品量的万分之一，而测试精度相近。对13C标记的水稻叶片尖进行测试，结果表明，叶缘、叶脉对CO2交换速率低于叶肉区域。激光剥蚀取样与稳定同位素质谱联用技术能够原位、在线获得动植物等生态样品碳同位素空间分布信息，分辨率低至50 μm，在环境、农林、生态学等领域具有广阔的应用前景。
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