弓形虫基因工程疫苗研究进展

    赵海忠　李良华　宋忠旭　孙华　彭先文　梅书棋

    摘要：弓形虫病是严重危害人和动物健康的重要人畜共患病。疫苗接种是目前防控弓形虫病的主要手段。根据国内外弓形虫病研究的现状，简要介绍了弓形虫基因结构、主要编码蛋白和相关基因工程疫苗的最新研究进展，主要包括核酸疫苗、重组卡介苗、多肽疫苗、基因缺失苗等，最后对基因工程疫苗研究工作的继续开展提出了建议。

    关键词：弓形虫；基因；抗原蛋白；基因工程疫苗

    中图分类号：S852.7 文献标识码：A 文章编号：1007-273X（2019）04-0010-03

    弓形虫病（Toxoplasmosis）是由刚地弓形虫（Toxoplasma）所引起的人畜共患病。它广泛寄生在人和动物的有核细胞内。该病呈全球性分布和流行，孕妇、宠物喂养者、饲养员、屠宰人员及免疫功能低下者均为高危人群。据估计，全世界约有25%的人受感染，我国人群感染率约为5%～20%[1]。弓形虫在家畜中主要感染猪，以高热、呼吸困难、神经症状以及繁殖障碍为特征。近年来，弓形虫病在猪场发病率呈上升趋势，死亡率高达60%，给养猪业造成了较大经济损失[2]。因此，该病的防治工作十分重要，而疫苗免疫仍是预防该病的重要手段[3]。随着近几年对弓形虫相关基因和抗原结构研究的不断深入，弓形虫基因工程疫苗的研发取得了重大进展。本文主要对弓形虫基因结构与基因工程疫苗研究的最新进展进行阐述，以期为科研工作者更好地防治该病提供参考。

    1 基因组结构

    弓形虫DNA以线粒体DNA、染色体DNA和类质共生体DNA三种形式存在。线粒体DNA为环形，长度为36 kb。有一段约10 kb的颠倒重复序列。它除了编码与呼吸链相关蛋白外，还有可能参与编码弓形虫期转换的有关物质[4]。染色体DNA中G+C含量约为55%，没有甲基化的碱基[5]。类质共生体DNA也为环形，大小35 kb，是以其他真核生物类质体DNA序列为探针，通过原位杂交而发现的序列[6]。研究发现，类质共生体有绿藻原性，在漫长的进化过程中才逐渐演变成细胞器，它可能编码DNA依赖的RNA聚合酶亚单位β和β′核糖体RNA小亚单位[7]。

    2 主要编码蛋白与基因工程疫苗

    2.1 P30蛋白抗原

    P30基因为单一拷贝基因，全长1 634 bp，不含有内含子。P30突变导致虫体结合细胞能力显著下降，在黏附宿主细胞膜过程中起着配体作用，在原核、真核和昆虫细胞中均能表达出融合和非融合形式的重组蛋白[8]。P30表达产物的抗原活性与蛋白分子的折叠存在密切相关[9]，分子构象高度决定其抗原性。易艳军[10]构建了弓形虫P30基因的乳酸乳球菌表达质粒L2Ps-P30-T，并在乳酸乳球菌中表达P30基因，表达产物口服免疫小鼠，结果表明在体液免疫、黏膜免疫水平上诱导小鼠对弓形虫感染具有保护力。魏庆宽等[11]扩增HBsAg目的基因片段，并将HBsAg目的基因克隆至pcDNA3-p30-ROP2表达载体中，构建了pcDNA3-HBsAg-p30-ROP2多基因真核表达载体，该载体包含了p30-ROP2和HBsAg目的基因的完整序列，为进一步研究多基因核酸疫苗奠定了基础。

    2.2 P22蛋白抗原

    P22蛋白抗原是第2個被克隆和测序的弓形虫表面抗原。速殖子入侵的过程由P22介导，锚定于有核细胞表面，并进入有核细胞内部[12]。抗P22蛋白抗体可以阻断弓形虫的再定位。P22蛋白除介导弓形虫速殖子的入侵过程外，在弓形虫速殖子向缓殖子转化的过程中发挥作用。赵东岳等[13]将去掉信号肽和C-末端的基因片段插入原核表达载体pGEX-4T-3后转化到大肠杆菌DH5α，采用诱导进行可溶性表达。重组蛋白具有良好的完全抗原活性，这也为弓形虫的基因重组疫苗研究奠定了基础。全娟花等[14]将弓形虫SAG2基因插入pCMV-Taq2B载体，使其在真核细胞中高水平稳定表达，构建含pCMV-Taq2B-Surface antigen 2（表面膜抗原2）成分的核酸疫苗，结果表明，免疫组能产生特异性IgG抗体，末次免疫后28 d达到峰值。

    2.3 P43蛋白抗原

    P43蛋白抗原存在于弓形虫所有入侵阶段的膜蛋白。未成熟的P43蛋白由385个氨基酸残基组成，含有一个N端信号肽和GPI。P43蛋白是参与弓形虫入侵宿主细胞过程的主要分子，介导对宿主细胞的识别和黏附[15]。朱刚[16]以RH株弓形虫P43蛋白为抗原分子，构建了重组质粒，并以兔抗P43蛋白血清检测到该基因所表达蛋白具有免疫原性。对小鼠肌注后，检测小鼠产生了细胞免疫和体液免疫应答，此DNA疫苗对小鼠感染弓形虫具有一定的免疫保护。

    2.4 P35蛋白抗原

    张仁利等[17]成功地进行了弓形虫P35蛋白的基因克隆，对P35蛋白进行分析，发现其C端区有高亲水性区域在201～225和301～340氨基酸处，同时也发现其编码的氨基酸序列含有多个T、B细胞的表位，P35蛋白可以产生部分的免疫保护力。易俊波等[18]则采用弓形虫RH株表面抗原P35的cDNA序列设计一对引物，扩增出P35的基因片段，并将其克隆到T载体中。亚克隆至原核表达载体pET-KDO后，在大肠杆菌中经IPTG诱导表达，得到了具有良好抗原性的重组P35融合蛋白。

    2.5 P23蛋白抗原

    P23抗原为毒力相关抗原，位于速殖子表膜。该抗原仅见于RH株和BK株等强毒株，临床分离的弱毒株未发现[19]。研究人员在研究弓形虫疫苗的过程中发现了一种24 ku的多肽，该多肽能产生一定的免疫保护性，能阻止弓形虫速殖子入侵宿主细胞。该多肽基因表达产物能在动物体内产生抗P23抗体，表明P23蛋白可能包含有该多肽的免疫表位。P23蛋白有望成为研发新型基因工程疫苗的重要抗原。

    2.6 棒状体蛋白

    2.6.1 棒状体蛋白1 棒状体蛋白1基因是一个单拷贝基因，全长约为2.1 kb，蛋白分子质量约60.5 kDa，其N端为富含脯氨酸的酸性结构域，后面则是碱性羧基末端区域。用抗棒状体蛋白1基因的单抗处理后，弓形虫对宿主细胞的黏附受到抑制。棒状体蛋白1基因尽管能诱导机体系统和黏膜局部体液免疫应答，但并不能产生明显的免疫保护[20]。

    2.6.2 棒狀体蛋白2 棒状体蛋白2是弓形虫棒状体分泌的另一个重要蛋白，基因全长2 234 bp，不含内含子，未成熟的前体蛋白约66 kDa，成熟的棒状体蛋白2约为54 kDa。该蛋白参与弓形虫侵入后纳虫泡膜的形成，在弓形虫生活史的速殖子期、缓殖子期以及子孢子期均有表达。研究发现棒状体蛋白2的氨基端存在一系列的两亲性螺旋，单一的螺旋就能黏附于细胞膜上，共同作用则优先黏附于新形成的纳虫泡膜。肖婷等[21]构建了pEGFP-N1-HBsAg-p30-ROP2真核表达载体，然后转染293T细胞并正确表达融合蛋白，该融合蛋白能被弓形虫P30单抗腹水、ROP2鼠源多抗和乙肝患者血清识别，具有免疫反应性，为乙肝和弓形虫联合疫苗的研制奠定了良好基础。

    2.7 微线体蛋白

    2.7.1 微线体蛋白2（MIC2） 微线体蛋白2基因是单拷贝基因，有3个内含子，全长2 307 bp，编码含769个氨基酸残基，且698～718位氨基酸残基间存在一个短的疏水信号肽，为典型的跨膜区。TgMIC2在虫体的各期均有表达，TgMIC2和TgM2AP以1∶1的比例形成一个包含3个aB二聚体六聚体复合体。郑斌等[22]采用定点突变技术，准确找到了MIC2与醛缩酶的作用位点为色氨酸（W）。而有关研究表明MIC2蛋白是弓形虫感染的主要毒力因素，因而构建MIC2缺陷株是开发有效活弱毒疫苗的重要方法[23]。

    2.7.2 微线体蛋白3（MIC3） 微线体蛋白3基因无内含子，ORF编码一个富含半胱氨酸的395个氨基酸残基多肽，N 端有一较短的疏水信号肽，无跨膜区域氨基酸序列中含5个表皮生长因子样结构域，其中3个串联排列，而另2个则与前3个有重叠，具有一个几丁质连接样结构域，这种序列能跟宿主蛋白一样参与细胞与细胞、细胞与细胞外基质的相互识别作用。MIC3在弓形虫的各期都能表达，为该病诊断和疫苗研制非常有前景的候选分子[24]。唐菲等[25]原核表达了弓形虫RH株MIC3重组蛋白，并检测了该重组蛋白特异免疫反应性，这为利用该蛋白进行弓形虫病诊断与疫苗研究奠定了基础。

    2.8 致密颗粒蛋白

    2.8.1 致密颗粒蛋白1（GRA1） 致密颗粒蛋白1分子质量为23 kDa，含有2个钙结合域，通过调节钙离子浓度来稳定纳虫泡膜。刘慧颖等[26]通过构建致密颗粒蛋白GRA1基因真核重组表达质粒，在Hela细胞中表达GRA1蛋白。经检测，GRA1蛋白具有良好的反应原性。构建的重组真核表达质粒制成的核酸疫苗，在小鼠攻毒试验中表现出良好的免疫保护性，为该类疫苗的研发奠定了基础。

    2.8.2 致密颗粒蛋白2（GRA2） 致密颗粒蛋白2含一个长241 bp的内含子，长约1.3 kb，初级翻译产物为一个185个氨基酸的多肽，含有23个氨基酸长的信号肽，富含丝氨酸和苏氨酸。GRA2依赖3个两性a螺旋，在弓形虫侵入后起着诱导纳虫泡膜表面网络结构形成的作用。研究人员利用重组蛋白和佐剂单磷酰脂质免疫小鼠后，能诱导产生高比例的IgG2a/IgG1特异性抗体，脾细胞体外经分泌-排泄抗原刺激后产生大量的IFN-γ和IL-2。攻毒试验结果表明该重组蛋白能有效抵抗弓形虫慢性感染[27]。

    2.8.3 致密颗粒蛋白3（GRA3） 致密颗粒蛋白3分子质量为30 kDa，存在于内管网和纳虫泡膜。为单拷贝基因，其cDNA序列N端有2个起始密码子，开放阅读框含有一个22个氨基酸的疏水区和一个信号肽。沈继龙等[28]研究表明，GRA3无有效的3D结构，抗原表位少，不宜作为弓形虫有效疫苗候选分子。

    3 展望

    弓形虫基因工程疫苗的研制方向：对弓形虫与宿主之间的关系作深入研究，特别是针对弓形虫各期所共有的保护性抗原及保护性表位的鉴定，继续深入研究P30基因核酸疫苗、P22蛋白重组疫苗、P43蛋白重组疫苗、P23蛋白多肽疫苗、微线体蛋白2基因缺失苗等，在实用性、安全性及有效性方面显示出强大的潜力。寻找更佳的免疫佐剂、优化免疫程序，提高基因工程疫苗的实用效果。

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