KIF3B基因对三阴性乳癌细胞生物学特性和阿霉素化疗敏感性的影响

    张润泽 郑艳 贾惠卿 迟菁华 项锋钢 王成勤

    

    

    

    [摘要] 目的 研究KIF3B基因對三阴性乳癌MDA-MB-231细胞生物学特性和阿霉素化疗敏感性的影响。

    方法 用Western blot技术检测KIF3B在人三阴性乳癌细胞系MDA-MB-231和MDA-MB-468中的表达，取KIF3B高表达细胞MDA-MB-231用于后续实验。用sh-NC质粒转染MDA-MB-231细胞作为对照组，用sh-KIF3B沉默质粒转染MDA-MB-231细胞作为实验组。应用Western blot方法检测基因沉默效率和基因沉默后上皮-间质转化（EMT）相关蛋白E-cadherin、基质金属蛋白酶2（MMP-2）和MMP-9表达变化，Transwell实验检测细胞迁移、侵袭能力变化，流式细胞术检测细胞周期变化，MTT实验检测细胞增殖能力和对阿霉素化疗敏感性的变化。

    结果

    KIF3B在三阴性乳癌细胞MDA-MB-231中高表达，而在MDA-MB-468中低表达（t=19.92，P<0.01）。沉默MDA-MB-231细胞KIF3B基因后，细胞迁移、侵袭数目明显减少（t=29.54、18.32，P<0.01），G0/G1期细胞比例降低而G2/M期细胞

    比例增加（t=4.82、19.05，P<0.01），同时细胞增殖能力被显著抑制（F=7.56～270.09，P<0.01），对阿霉素化疗敏感性明显增加（F=26.37～167.11，P<0.01），E-cadherin表达升高（t=19.71，P<0.01），而MMP-2和MMP-9表达降低（t=26.57、16.11，P均<0.01）。

    结论 沉默三阴性乳癌MDA-MB-231细胞KIF3B基因表达可以抑制细胞增殖、阻滞细胞周期并增加细胞对阿霉素化疗敏感性，并可以通过EMT抑制细胞迁移和侵袭。

    [关键词] 驱动蛋白超家族蛋白3B;三阴性乳癌;细胞增殖;肿瘤转移;细胞周期;多柔比星;抗药性，肿瘤

    [中图分类号] R737.9

    [文献标志码] A

    [文章编号] 2096-5532（2021）03-0321-06

    doi：10.11712/jms.2096-5532.2021.57.122

    [开放科学（资源服务）标识码（OSID）]

    [网络出版] https：//kns.cnki.net/kcms/detail/37.1517.R.20210628.1618.004.html;2021-06-29 09：40：11

    EFFECT OF THE KIF3B GENE ON THE BIOLOGICAL CHARACTERISTICS AND DOXORUBICIN CHEMOSENSITIVITY OF TRIPLE-NEGATIVE BREAST CANCER CELLS

    ZHANG Runze， ZHENG Yan， JIA Huiqing， CHI Jinghua， XIANG Fenggang， WANG Chengqin

    （Department of Pathology， School of Basic Medicine， Qingdao University， Qingdao 266071， China）

    [ABSTRACT]Objective To investigate the effect of the KIF3B gene on the biological characteristics and doxorubicin chemosensitivity of triple-negative breast cancer MDA-MB-231 cells.

    Methods Western blot was used to measure the expression of KIF3B in human triple-negative breast cancer cell lines MDA-MB-231 and MDA-MB-468， and the MDA-MB-231 cells with high expression of KIF3B were selected for subsequent experiments. MDA-MB-231 cells transfected with sh-NC plasmid were established as control group， and those transfected with sh-KIF3B silencing plasmid were established as experimental group. Western blot was used to measure silencing efficiency and changes in the expression of the epithelial-mesenchymal transition （EMT）-related proteins E-cadherin， matrix metallopeptidase-2 （MMP-2）， and matrix metallopeptidase-9 （MMP-9）; Transwell assay was used to measure the changes in cell migration and invasion abilities; flow cytometry was used to observe the change in cell cycle; MTT assay was used to measure the changes in proliferative capacity and doxorubicin chemosensitivity.

    Results KIF3B showed high expression in triple-negative breast cancer MDA-MB-231 cells and low expression in MDA-MB-468 cells （t=19.92，P<0.01）. After the KIF3B gene was silenced in MDA-MB-231 cells， there were significant reductions in the number of migrating and invading cells （t=29.54，18.32;P<0.01）， a significant reduction in the proportion of cells in G0/G1 phase， and a significant increase in the proportion of cells in G2/M phase （t=4.82，19.05;P<0.01）. Meanwhile， cell proliferation was significantly inhibited （F=7.56-270.09，P<0.01）， and doxorubicin sensitivity was significantly increased （F=26.37-167.11，P<0.01）. There were an increase in the expression of E-cadherin （t=19.71，P<0.01） and reductions in the expression of MMP-2 and MMP-9 （t=26.57，16.11;P<0.01）.

    Conclusion Silencing of the KIF3B gene in triple-negative breast cancer MDA-MB-231 cells can inhibit cell proliferation， cause cell cycle arrest， and increase the doxorubicin chemosensitivity of cells， and it can also inhibit cell migration and invasion through EMT.

    [KEY WORDS]kinesin superfamily proteins 3B; triple negative breast neoplasms; cell proliferation; neoplasm metastasis; cell cycle;doxorubicin; drug resistance， neoplasm

    乳癌是全世界女性最常见的恶性肿瘤，也是第二大常见的癌症致死原因[1]。据统计，乳癌发病率占全身各种恶性肿瘤的7%～10%。三阴性乳癌（TNBC）是指雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）和人表皮生长因子受体（HER2）表达均为阴性的乳癌，占所有乳癌病理類型的12%～17%[2]。TNBC好发于相对年轻的妇女，具有预后差、复发率高、转移率高和死亡率高等特点，已成为近年来乳癌研究和关注的焦点。已有研究证实，与Luminal型和HER2过表达型的乳癌相比，TNBC对新辅助化疗更加敏感，其病理完全缓解（PCR）率更高[3]。

    驱动蛋白超家族蛋白（KIFs）是一类分子马达，在细胞内起着运输媒介的作用，它可以依靠微管等细胞骨架结构将细胞内货物（如囊泡、细胞器、蛋白质复合物和RNA等）运输到细胞内的指定位置[4]。KIFs有14个亚家族，由45个成员组成。KIF3B是KIF3亚家族的成员，它是一种重要的蛋白质，在有丝分裂期间，KIF3B负责囊泡运输和膜扩张，从而调节细胞迁移。近年来，KIF3B与疾病的发生和发展之间的关系越来越受到关注[5]。已有研究发现，KIF3B在胰腺癌、肝癌、口腔鳞癌、精原细胞瘤、胃癌、结肠直肠癌和前列腺癌中存在异常表达[5-11]。但目前尚未有关于KIF3B与TNBC关系的报道。本研究拟沉默乳癌细胞中KIF3B基因，以观察其对细胞增殖、迁移、侵袭、细胞周期、上皮-间质转化（EMT）相关蛋白表达和阿霉素敏感性的影响。

    1 材料与方法

    1.1 实验材料

    人TNBC细胞株MDA-MB-231和MDA-MB-468购自中国科学院（中国上海）;KIF3B抗体购自美国Santa Cruz公司;β-actin抗体购自武汉云克隆科技股份有限公司;E-cadherin抗体购自英国 Abcam 公司;基质金属蛋白酶2（MMP-2）和MMP-9抗体均购自北京博奥森生物技术有限公司;羊抗鼠和羊抗兔二抗均购自Bioworld公司;sh-KIF3B沉默质粒及sh-NC质粒购自上海吉凯基因化学技术有限公司;Transwell小室购自美国Corning公司;DMEM培养基购自美国Hyclone公司;Matrigel基质胶购自美国BD生物技术公司;胎牛血清购自美国Gibco公司;增强化学发光（ECL）试剂盒购于美国Millipore公司;LipofectamineTM 2000 购于美国Invitrogen公司;碘化丙啶（PI）溶液、MTT粉末、二甲基亚砜（DMSO）、盐酸阿霉素、结晶紫粉末均购自北京索莱宝科技有限公司;RNAseA溶液购于天根生化科技有限公司。

    1.2 实验方法

    1.2.1 细胞培养与转染 将MDA-MB-231细胞和MDA-MB-468细胞置于含有体积分数0.10胎牛血清的DMEM培养基中，在37 ℃、含体积分数0.05 CO2的培养箱中常规培养。用Western blot法检测MDA-MB-231细胞和MDA-MB-468细胞KIF3B表达，取KIF3B高表达细胞MDA-MB-231用于后续实验。转染前1 d将处于对数生长期的MDA-MB-231细胞接种到6孔板中，达到70%融合度时，按照说明书方法用LipofectamineTM2000把质粒转染细胞，培养72 h用于后续实验。将未经处理的MDA-MB-231细胞作为MOCK组，将转染sh-NC质粒的MDA-MB-231细胞作为sh-NC组，将转染sh-KIF3B沉默质粒的MDA-MB-231细胞作为sh-KIF3B组。

    1.2.2 Western blot法检测细胞中KIF3B及EMT相关蛋白表达 提取MDA-MB-231细胞和MDA-MB-468细胞蛋白，用BCA法检测蛋白浓度，加入蛋白上样缓冲液煮沸。行SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白，300 mA转膜2 h将蛋白转至PVDF膜上，室温下用50 g/L脱脂奶粉封闭2 h，分别加入一抗KIF3B（1∶500）、E-cadherin（1∶1 000）、MMP-2（1∶1 000）、

    MMP-9（1∶1 000）和β-actin（1∶4 000）

    4 ℃孵育过夜，TBST洗膜3次，加入相应二抗（1∶4 000）室温孵育2 h，重复TBST洗膜步骤，最后加入ECL后曝光显影并分析条带灰度值。目的蛋白相对表达量以目的条带灰度值/β-actin条带灰度值表示。

    比较不同细胞KIF3B表达效率，取KIF3B高表达细胞MDA-MB-231用于后续沉默实验。重复上述步骤，提取对数生长期的MOCK组、sh-KIF3B组和sh-NC组细胞蛋白，检测KIF3B沉默效率。

    1.2.3 Transwell实验检测细胞迁移及侵袭能力

    取对数生长期的sh-KIF3B组和sh-NC组细胞，用胰蛋白酶消化后重悬于无血清DMEM培养基，调整细胞密度为1×108/L，在Transwell小室上室（均匀铺稀释过的50 mL Matrigel基质胶，Matrigel基质胶∶无血清培养基=1∶8）均匀加入200 μL细胞悬液，下室加入600 μL含体积分数0.15胎牛血清的培养基。当观察到下室有细胞穿过后，取出上室，吸出培养基并用PBS冲洗，用棉棒轻轻擦去上室未穿过的细胞，多聚甲醛固定15 min，5 g/L结晶紫染色30 min，流水冲洗干净，晾干后200倍光镜下随机选取5个视野观察并计数。

    1.2.4 MTT实验检测细胞增殖 将处于对数生长期的sh-KIF3B组和sh-NC组细胞以每孔3×103个接种于96孔板，每组分别接种6个复孔，将细胞置于37 ℃、含体积分数0.05 CO2的培养箱中培养，分别于培养1、2、3、4、5 d后，向各孔中加入20 μL MTT（PBS配制，5 g/L）溶液并于培养箱孵育2 h，弃去上清液，每孔中加入DMSO溶液150 μL，低速震荡10 min，使用全功能微孔板检测仪检测各孔490 nm波长处的吸光度（A）值，分析数据并绘制细胞生长曲线。

    1.2.5 流式细胞术检测细胞周期 取对数生长期的sh-KIF3B组和sh-NC组细胞胰蛋白酶消化后离心，用预冷的PBS洗涤3次，加入体积分数0.70乙醇4 ℃固定过夜，再次使用PBS溶液洗涤3次后加入200 μL PBS和2 μL RNaseA（终浓度为20 mg/L）重悬细胞，37 ℃孵育30 min，再加入 500 μL PI 染液（终浓度为 50 mg/L），避光孵育30 min，最后使用流式细胞仪检测细胞周期分布。

    1.2.6 MTT實验检测细胞活性 将对数生长期的sh-KIF3B组和sh-NC组细胞，以每孔1×104个接种于96孔板，待细胞贴壁后，再分别加入阿霉素使其浓度达到0.10、0.25、0.50、1.00、2.00、5.00 μmol/L，同时设置空白组，每组设置6个复孔，继续培养48 h后，向各孔中加入20 μL MTT（PBS配制，5 g/L）溶液并于培养箱孵育2 h，弃去上清液，每孔加入DMSO溶液150 μL，低速震荡10 min，用全功能微孔板检测仪检测各孔490 nm波长处吸光度（A）值。计算各给药组的细胞存活率。细胞存活率（%）=（实验组A值-空白组A值）/（对照组A值-空白组A值）×100%。

    以上所有实验均独立重复3次。

    1.3 统计学分析

    应用SPSS 25.0软件进行统计学分析。正态分布计量数据以±s表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析及析因设计的方差分析。以P<0.05表示差异有统计学意义。

    2 结? 果

    2.1 TNBC细胞系中KIF3B蛋白表达及沉默效率

    Western blot法检测结果显示，KIF3B蛋白在MDA-MB-231中呈高表达，而在MDA-MB-468细胞中呈低表达，两种细胞KIF3B蛋白表达比较差异有统计学意义（t=19.92，P<0.01）。将MDA-MB-231细胞用于沉默KIF3B基因，分别转染sh-NC质粒和sh-KIF3B沉默质粒。Western blot法检测结果显示，sh-KIF3B组KIF3B蛋白表达较MOCK组和sh-NC组明显减少，差异有统计学意义（F=284.56，P<0.01）。表明KIF3B基因成功沉默。见图1。

    2.2 沉默KIF3B基因对TNBC细胞迁移、侵袭能力的影响

    Transwell迁移实验显示，沉默MDA-MB-231细胞KIF3B基因后，sh-KIF3B组迁移细胞数目（269.4±21.4）明显低于sh-NC组（754.2±29.8），差异有统计学意义（t=29.54，P<0.01）。侵袭实验显示，沉默MDA-MB-231细胞KIF3B基因后，sh-NC组侵袭细胞数目为（1 120.0±53.5）个，sh-KIF3B组为（452.7±33.5）个，两组比较差异有显著意义（t=18.32，P<0.01）。见图2。

    2.3 沉默KIF3B对TNBC细胞增殖能力的影响

    MTT实验结果表明，沉默KIF3B对TNBC细胞增殖能力影响的组别与时间之间存在交互效应（F组别×时间=49.601，P<0.01）。MDA-MB-231细胞转染sh-KIF3B质粒后，同一时间下sh-KIF3B组细胞增殖能力明显低于sh-NC组，差异有统计学意义（F=7.56～270.09，P<0.01）。见表1。

    2.4 沉默KIF3B對TNBC细胞周期的影响

    流式细胞术结果显示，sh-NC组和sh-KIF3B组G0/G1期细胞比例分别为（78.29±1.99）%和（71.55±1.39）%，G2/M期细胞比例分别为（4.72±0.32）%和（10.13±0.38）%。与sh-NC组相比，sh-KIF3B组细胞G0/G1期比例显著减少，而G2/M期比例则显著增多，差异均有统计学意义（t=4.82、19.05，P<0.01）。见图3。

    2.5 沉默KIF3B对TNBC细胞阿霉素敏感性的影响

    MTT实验结果显示，沉默KIF3B后TNBC细胞对阿霉素敏感性影响的组别与浓度存在交互效应（F组别×浓度=15.201，P<0.01）。在相同浓度阿霉素作用下，sh-KIF3B组细胞存活率较低，表明沉默KIF3B基因后MDA-MB-231细胞对阿霉素敏感性明显上升，差异有显著意义（F=26.37～167.11，P<0.01）。见表2。

    2.6 沉默KIF3B对EMT相关蛋白表达的影响

    sh-NC组和sh-KIF3B组细胞EMT相关蛋白E-cadherin、MMP-2和MMP-9的相对表达量见图4。与sh-NC组相比较，sh-KIF3B组E-cadherin表达升高，差异有统计学意义（t=19.71，P<0.01）;MMP-2和MMP-9表达降低（t=26.57、16.11，P<0.01）。

    3 讨? 论

    TNBC具有预后差、复发率高、转移率高和死亡率高等特点，已成为近年来乳癌研究和关注的焦点。由于缺乏相应治疗靶点，TNBC病人无法从内分泌治疗或抗HER2治疗中获益。因此，无论是早期还是晚期的TNBC病人，化疗是目前最主要的治疗方法，并且与其他亚型的乳癌病人相比，TNBC病人对化疗有更高的反应率。大量研究结果显示，TNBC对蒽环类和紫杉醇药物治疗敏感，目前临床上针对TNBC的新辅助化疗方案主要以蒽环类和紫杉醇药物为基础[12-13]。但除了传统化疗外，TNBC的治疗手段非常有限，因此迫切需要寻找一个新的TNBC治疗靶点。

    KIFs的功能已广为人知，其与神经退行性疾病、糖尿病和肾病等疾病的发生密切相关[14-16]。作为KIF3亚家族的成员，KIF3B参与许多生理过程，包括有丝分裂、减数分裂和大分子的运输。在有丝分裂期间，KIF3B扮演着囊泡运输和膜扩张的角色，KIF3B还可以调节细胞迁移、细胞周期，促进细胞增殖和存活[4]。KIF3B亚基突变使多囊肾病小鼠产生致命表型[17-19]。在远端肾小管酸中毒中，KIF3B和人肾阴离子交换剂1（kAE1）在人肾组织中共表达，并且KIF3B可能参与了HEK293T细胞中kAE1的积累[16]。KIF3B也在大鼠肾脏缺血/再灌注损伤和急性脊髓损伤中起着重要作用[20-21]。KIF3B也是皮质神经元可塑性的负调节剂[22]。大量研究表明，驱动蛋白广泛参与各种肿瘤的发生，其表达水平与许多肿瘤的发生直接相关[23-25]。有研究显示，在肝癌、精原细胞瘤、口腔鳞状细胞癌、胰腺癌、前列腺癌及胃癌等组织中均存在KIF3B高表达[5-9，11]。在结直肠癌中过表达KIF3B可以逆转LEF-AS1敲降引起的细胞增殖、迁移和侵袭抑制并促进细胞的凋亡[10]。hsa_circ_0032462可以调节骨肉瘤细胞中KIF3B水平，而KIF3B可逆转hsa_circ_0032462过表达诱导的骨肉瘤细胞增殖以及转移[26]。然而，目前尚无敲降KIF3B影响TNBC细胞生物学特性和阿霉素化疗敏感性的报道。

    本文Transwell实验结果显示，sh-KIF3B组细胞迁移和侵袭数量明显减少，证明沉默MDA-MB-231细胞KIF3B基因可以下调细胞迁移和侵袭能力;MTT实验结果表明，沉默KIF3B基因后细胞增殖能力下降，且在相同浓度阿霉素处理下KIF3B沉默组细胞存活率较低，表明沉默KIF3B可以抑制细胞增殖，并提高细胞对阿霉素的敏感性;流式细胞术结果显示，KIF3B基因沉默后，G0/G1期细胞比例显著下降，而G2/M期细胞比例显著升高，表明沉默KIF3B诱导了细胞周期阻滞。EMT是肿瘤发生发展过程中的重要现象，也是肿瘤细胞发生浸润迁移和继发性转移的重要机制之一[27]。EMT在乳癌增殖和转移中也有着重要意义[28]。本研究检测了KIF3B基因沉默后EMT相关蛋白表达变化，结果显示沉默KIF3B基因后MMP-2和MMP-9表达降低，而E-cadherin表达升高，差异有显著性。表明沉默KIF3B可以通过EMT途径调节TNBC细胞的迁移和侵袭。

    综上所述，沉默TNBC细胞中KIF3B基因可以抑制细胞迁移、侵袭和增殖能力，阻滞细胞周期，降低MMP-2和MMP-9表达，提高E-cadherin表达。KIF3B基因沉默还可以与阿霉素协同作用，改善治疗效果。因此，KIF3B有望成为新的TNBC治疗靶点。

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    （本文编辑 黄建乡）