乳腺癌生物标志物钙网蛋白的核酸适配体筛选及血清检测和乳腺癌细胞识别

    孙淼 杨歌 赵毅 屈锋

    

    

    

    摘?要?钙网蛋白（CRT）与许多癌症的发生密切相关，被认为是乳腺癌侵袭和转移的有效新型生物标志物以及乳腺癌分期和预后的评价指标。本研究利用毛细管电泳-指数富集配体进化技术（CE-SELEX）筛选并鉴定了CRT的核酸适配体。毛细管电泳法、等温滴定量热法及纳米金比色法表征结果表明，适配体Apt 23对CRT具有较高的亲和力和特异性。FAM标记的Apt 23（FAM-Apt 23）可用作毛细管电泳的亲和探针，采用激光诱导荧光检测器，检测血清中CRT的浓度范围为1～1000 nmol/L，检出限为0.5 nmol/L。FAM-Apt 23也可用作CRT的免疫荧光成像探针，可结合在CRT过表达的乳腺癌细胞4T1的表面。初步研究结果表明，利用毛细管电泳筛选的核酸适配体Apt 23可用于CRT识别和检测的探针。

    关键词?钙网蛋白;核酸适配体;毛细管电泳-指数富集配体系统进化

    1?引 言

    钙网蛋白（Calreticulin，CRT）是内质网中的一种高度保守的伴侣蛋白。当受到内源性刺激时，其与细胞膜内侧的磷脂酰丝氨酸结合，从胞浆面外翻到细胞膜外侧面，易位至细胞膜的表面[1，2]。细胞表面的CRT可对吞噬细胞发出“Eat-me（吃我）”的信号，通过刺激机体免疫效应诱导癌细胞被吞噬[3]。研究者对癌细胞中CRT的表达量与癌症的关系已进行了大量研究，在口腔癌[4]、乳腺癌[5～8]、胃癌[9]、结直肠癌[10]、膀胱癌[11]、胰腺癌[12]、前列腺癌[13]和阴道癌[14]中，CRT的表达量显著上调，其中，对乳腺癌中CRT作用的研究最多。CRT参与乳腺癌信号传导的p53和MAPK途径，是有效的新型乳腺癌侵袭和转移生物标志物;CRT在乳腺癌N0～N2期的上调表达可作为诊断乳腺癌分期和预后的指标。此外，CRT还与不同癌症的发展有密切联系，CRT的表达水平深刻影响癌细胞的增殖及其发生和分化，不同肿瘤中CRT的不同表现可能取决于肿瘤细胞的类型，并决定相应的临床阶段[15]。

    CRT的常规检测方法是利用其抗体进行免疫分析[16～18]，但抗體的制备获得过程较为繁琐，批次间稳定性较差，入胞也困难，而且价格昂贵。核酸适配体（Aptamer）是通过指数富集配体进化技术（SELEX）体外迭代过程筛选获得的单链RNA或者DNA分子[19，20]。作为新型识别分子，理想的核酸适配体能与靶标以高亲和力和高特异性结合，可通过化学合成，性质稳定，合成成本低，分子量比抗体小得多，易穿透细胞膜且毒性低[21]。近年来，随着核酸适配体研究的深入，其在蛋白质有关的检测、细胞成像、疾病诊断与靶向治疗等领域受到广泛关注[22]。目前，蛋白质的核酸适配体报道较多，为核酸适配体的生物医学和药物应用奠定了基础。文献报道的蛋白质筛选方法主要以磁珠/微球-SELEX、微柱-SELEX以及硝化纤维素膜结合-SELEX等固定蛋白质的筛选方法为主，通常需要8～15轮筛选才能获得所需的核酸适配体[23]。多轮的筛选引起罕见序列的丢失以及PCR偏性的发生，且蛋白质的固定会减少核酸分子的结合位点，以及导致非特异性和低亲和力核酸序列的保留。毛细管电泳-SELEX（CE-SELEX）无需固定蛋白质，可在模拟人体生理环境的溶液条件下，分离出与蛋白质相互作用的核酸分子，经1～4轮筛选即可得到目标物的适配体[24，25]。

    本研究利用CE-SELEX技术，筛选了可与CRT高亲和性和特异性结合的核酸适配体，目前，此蛋白的适配体还未见报道。在4轮筛选过程中，表征了每轮富集库对CRT的结合比和亲和力，以此监控筛选的富集进程。最终选择第3轮筛选的PCR产物进行高通量测序。根据序列出现的频率及其二级结构，选择了6条核酸适配体测定亲和力，以平衡解离常数（KD）最小的Apt 23为CRT的适配体，进一步考察其特异性。将经过荧光FITC标记的适配体FITC-Apt 23用于血清稀释液检测，可检出加标的CRT。将其用于乳腺癌细胞成像，证明了CRT在肿瘤细胞表面的过量表达，表明所筛选的适配体Apt 23具有CRT识别和检测的应用价值

    2?实验部分

    2.1?仪器与试剂

    P/ACE MDQ毛细管电泳仪（美国Beckman-coulter公司）;S1000TM PCR仪（新加坡Bio-RAD公司）;TGreen OSE-470超薄型蓝光切胶仪（北京天根生化公司）;冷冻高速离心机（美国赛默飞世尔公司）;MicroCal ITC 200等温滴定量热仪（英国马尔文仪器公司）;G：BOX F3高级凝胶成像系统（美国Syngene公司）;Nikon N-SIM 超分辨率显微镜（日本尼康公司）。

    重组人钙网蛋白（Calreticulin，CRT，美国Cloud-Clone 公司）;鼠免疫球蛋白G（Immunoglobulin G，IgG，武汉华美生物工程有限公司）;人血清白蛋白（Human serum albumin，HSA，美国Sigma-Aldrich公司）;人细胞程序性死亡-配体（Programmed cell death-ligand，PDL1，美国Cloud-Clone公司）;人血红蛋白（Hemoglobin，Hb，北京索莱宝科技有限公司）;IgG-FITC与HSA-FITC （北京博尔西科技有限公司）;小鼠乳腺癌细胞（4T1）与小鼠乳腺正常上皮细胞（EpH4-Ev）（美国模式菌种收集中心ATCC）;N15、N30核酸库：5-FAM-ACCGACCGTGCTGGACTCT-15N（30N）-AGTATGAGCGAGCGTTGCG-3，引物P1： 5-ACCGACCGTGCTGGACTCT-3，荧光FAM标记的引物5-FAM-ACCGACCGTGCTGGACTCT-3，引物P2： 5-CGCAACGCTCGCTCATACT-3（上海生工生物工程公司）;混合人血清与细胞完全培养基DMEM（北京中科迈晨科技有限公司）;细胞培养用PBS溶液（美国Hyclone公司）;细胞染色液（Hoechst 33258和Hoechst 33342，武汉亚科因科技有限公司）;5×TBE电泳缓冲液、双蒸水（ddH2O）、琼脂糖、2×Taq PCR 混合酶、10000×GeneGreen 核酸染料、50bp DNA ladder、6×DNA loading buffer（北京天根生化科技有限公司）;Na2B4O7·10H2O、H3BO3、Na2HPO4·12H2O、NaH2PO4·2H2O、NaOH、NaCl、三氯甲烷、乙醇（北京化工厂）;异戊醇（天津津科精细化工研究所）;活化剂（澳大利亚Anteo Technologies公司）;胶体金颗粒（AuNPs，上海华蓝化学公司）;75 μm/200 μm内径熔融石英毛细管（河北奥泰克生物科技有限公司）。

    2.2?实验方法

    2.2.1?溶液配制?1 mL 0.05 mol/L 硼砂溶液与9 mL 0.2 mol/L 硼酸混合，加水稀释至50 mL，配制成50 mmol/L硼酸-硼砂缓冲液（pH 7.4）。称取0.85 g NaCl、 0.22g Na2HPO4和0.2 g NaH2PO4，加水溶解并定容至100 mL，配制10 mmol/L PBS缓冲液（pH 7.4）。使用前，缓冲溶液通过0.22 μm滤膜过滤。

    蛋白溶液配制：将CRT粉末用pH 7.4的PBS（0.01 mol/L）溶解，制备50 μmol/L的样品溶液。HSA、Ig G、PDL1、Hb蛋白用蒸馏水稀释。

    干粉状核酸库用50 mmol/L硼酸盐溶液（pH 8.2） 溶解，配制成100 μmol/L核酸库溶液。使用前将核酸库在94℃变性10 min，然后以0.5℃/s 缓慢冷却至25℃。

    2.2.2?毛细管电泳筛选的条件及方法?选用75 μm熔融石英毛细管（有效长度/总长40.0 cm/50.2 cm），激光诱导荧光检测器（激发波长/发射波长= 488 nm/520 nm）;电泳缓冲液：50 mmol/L硼酸-硼砂缓冲液（pH 7.4）;孵育缓冲液：PBS缓冲液（含有0.1 mmol/L Ca2+、1 mmol/L Mg 2+及2 mmol/L K+，pH 7.4）;?37℃孵育15 min。孵育样品进样： 0.5 kPa，5 s;20 kV，25℃分离。收集电泳中的CRT-N30复合物馏分。

    2.2.3?PCR扩增及产物的分离纯化?将收集复合物馏分依次进行对称PCR、不对称PCR、乙醇沉淀浓缩和切胶回收，逐级获得ssDNA筛选次级库。将含上下游引物和TaqPCR酶的溶液与收集的CRT-N30复合物混合，进行对称PCR扩增。条件： 94℃，1 min;94℃，30 s;58℃，30 s;72℃，30 s，35轮循环。改变上下游引物比例，进行不对称PCR扩增，4轮循环。将无水乙醇与PCR产物混合均匀，4℃离心15 min（15000 r/min）后，将乙醇沉淀物进行凝胶电泳，电压90 V。取出凝胶电泳的目标条带，加入 ddH2O和Tris 饱和酚，4℃离心 15 min（12000 r/min）。在上清液中加入三氯甲烷-异戊醇（24∶1，V/V），4℃离心 5 min（12000 r/min）。加入20℃的无水乙醇和3 mol/L 醋酸钠，混合后，4℃离心 15 min（12000 r/min）。弃去上层溶液，将离心管置于通风橱干燥至白色沉淀析出，得到1轮筛选后的次级核酸库。对4轮筛选获得的次级库亲和力进行评估，最终选择第3轮筛选的PCR产物测序。

    2.2.4?核酸序列分析与亲和力分析?将第3轮筛选产物送至上海生工生物工程股份有限公司测序。测序结果用Mfold程序预测其二级结构。对核酸库或筛选的核酸序列进行FAM标记，使用CE-LIF检测核酸库或核酸序列与CRT的复合物形成，按公式（1）计算核酸库或Apt X与CRT复合物的平衡解离常数KD[26]。测定的解离常数越小，亲和力越强。

    其中，P0和DNA0为CRT和ssDNA的初始浓度。ADNA是游离ssDNA的峰面积，Adiss是电泳过程中CRT-ssDNA的解离区面积，ADNA·P是复合物峰面积。各峰面积由电泳图直接确定，ADNA和Adiss的峰面积以游离ssDNA的迁移时间进行校正，ADNA·P峰面积以复合物峰的迁移时间进行校正。

    按照公式（2）计算ssDNA核酸库与CRT的结合比（BF）：

    其中，I0为未加入CRT的游离ssDNA 峰面积，I1为加入CRT 后的游离ssDNA 峰面积。

    2.2.5?等温滴定量热法验证Apt 23的亲和力

    样品池中加入240 μL CRT（1 μmol/L）溶液，滴定注射器中加入40 μL Apt 23（10 μmol/L）。滴定体积为2 μL，共20滴，滴定间隔为150 s，转子搅拌转速为750 r/min，使用Origin 7.0進行滴定后的数据处理。

    2.2.6?纳米金比色法验证Apt 23的特异性?在96孔板的各孔中，依次加入50 μL胶体金、25 μL Apt 23、25 μL CRT及其它对照蛋白（400 nmol/L）。室温孵育15 min后，在孔中分别加入10 μL 1 mol/L NaCl溶液。记录96孔板中每孔的颜色变化，测定其紫外-可见吸光度。

    2.2.7?激光共聚焦显微镜下基于Apt 23的细胞成像

    取处于对数生长期的传代细胞，用0.25%胰酶消化。取其细胞悬液，均匀平铺于共聚焦显微镜专用培养皿中，细胞约占底部面积的90%～95%，PBS洗涤细胞2～3次。将250 nmol/L（500 μL）FAM-Apt 23与1×105个单层细胞置于冰上，避光孵育30 min后，用PBS洗涤3次。加入10 μg/mL Hoechst溶液染色细胞核5 min，将细胞再次洗涤后，均匀平铺于共聚焦显微镜专用培养皿中，加入500 μL PBS，进行激光共聚焦成像分析。细胞用Hoechst染色时，使用波长352 nm紫外光激发，发射波长为410～460 nm;用FITC染色时，使用波长488 nm的氩离子激光激发，发射波长为510～550 nm。

    3?结果与讨论

    3.1?CRT核酸适配体筛选方法

    采用CE-SELEX方法（图1A）从随机ssDNA文库中筛选CRT的核酸适配体。筛选过程中，使用CE测定每轮次级库与CRT 的结合比和解离常数（KD）。在1～3轮筛选时，结合比随筛选轮数增加而增大，KD则减小（图1B），说明筛选过程中，与CRT结合的核酸序列得到富集。3轮筛选后获得解离常数为nmol/L级的CRT 次级库，结合比达到最大。第4轮筛选未能进一步提高亲和力，结合比反而降低，KD增大。在以往的CE-SELEX研究中，这种筛选波动情况也常有报道[27～29]。最终，将第3轮筛选获得富集的ssDNA库进行扩增及高通量测序。

    3.2?候选核酸适配体的序列结构分析

    根据高通量测序结果，对81938个序列中18个频率较高的核酸序列进行多重序列比对和二级结构分析。这18条序列中，有一些具有相似的二级结构（电子版文后支持信息 图 S1）。如Apt 2、Apt 12 和Apt 20 等含有3个小臂的大圆形结构，Apt 23、Apt 38 和Apt 45 等含2～3个长臂的长条结构。最终，本研究选择了6 条具有不同特征结构的序列（Apt 12、Apt 23、Apt 24、Apt 25、Apt 38和Apt 45）作为候选核酸适配体序列，其序列组成见表1。

    3.3?候选核酸适配体的亲和力和特异性分析

    利用CE-LIF检测FAM标记的核酸适配体与CRT孵育的混合物，并通过公式（1）计算得到KD（表1）。上述6条核酸序列的KD在0.6～2.4 μmol/L范围内。其中，Apt 23的KD为（670 ± 56）nmol/L，亲和力最强。利用等温滴定量热法（ITC）测定Apt 23的KD值，验证其亲和力。在25℃，用10 μmol/L Apt 23 滴定1 μmol/L CRT，基于非线性拟合方法求得KD为1.32 μmol/L，比CE法测定结果约大一倍，但仍达到μmol/L级（图2）。CE法和ITC法的KD测定结果均表明，经过3轮CE-SELEX筛选获得的Apt 23对CRT具有良好的亲和力。

    进一步评估了Apt 23对CRT结合的特异性，检测Apt 23是否可以识别CRT以及其它4种血清中重要的功能蛋白质： Hb、HSA、IgG以及PDL1。CE-LIF检测结果（图3A）表明，加入CRT后，2.1 min形成Apt 23-CRT的复合物峰，并在Apt 23峰（4.4 min）前有复合物解离区峰（4.1 min）。加入相同浓度的其它4种蛋白，电泳图都没有明显变化，说明Apt 23特异性识别CRT，形成了复合物。通过AuNPs比色法也可方便地验证Apt 23的选择性。由图3B可见，当分散的AuNPs体系（红色）中加入400 nmol/L CRT，其与AuNPs 表面的Apt 23结合，导致分散的AuNPs 聚集变蓝，而其它4种蛋白的加入均未使Apt-AuNPs混合体系变色。并且，Apt 23-AuNPs与CRT混合体系的吸光度比值（A520 nn/A620 nm）最小，低于其它阴性对照蛋白（图3C）。上述结果表明，Apt 23可特异性识别CRT。此外，截短Apt 23得到Q2～Q5，其亲和力与原序列Apt 23相似（电子版文后支持信息表S1）。其中，Q2和Q3也可特异性识别CRT（ 电子版文后支持信息 图S2）。

    3.4?CE-LIF法检测血清中的CRT

    分别用含有0.1 mmol/L Ca2+、20 mmol/L Mg2+及2 mmol/L K+的孵育缓冲液稀释血清样品，且保持孵育温度为4℃（图S3）。将Apt 23作为亲和探针，加入稀释50倍的人血清样品，再将其与不同浓度的CRT孵育。随着CRT浓度增加，复合物峰面积逐渐增大（图4A）。CRT 浓度在1 nmol/L～1 μmol/L范围内与复合物峰面积呈良好的线性关系，线性方程为 y=9925.8334x+ 4173022.4929，R2=0.9880，检出限可达到0.5 nmol/L（S/N=3）（图4B）。上述结果表明，Apt 23结合CE可检测复杂的血清基质中微量的CRT。

    3.5?激光共聚焦显微镜表征Apt 23 对细胞的识别

    人源和鼠源的乳腺癌细胞的细胞膜上含有CRT[30～34]。将Apt 23分别与正常鼠源乳腺细胞EpH4-Ev和鼠源乳腺癌模式细胞4T1孵育，评估Apt 23对靶细胞的特异性识别能力。以未经筛选的初始核酸库N30为对照组，比较筛选的适配体Apt 23与初始核酸库对细胞的结合差异。利用Hoechst染細胞核确定细胞位置，以FAM标记的Apt 23确定CRT所在位置。如图5所示，与Apt 23 孵育后的细胞4T1边缘有明亮、均匀的荧光信号，而EpH4-Ev 细胞则未检测到荧光信号。初始核酸库N30与两种细胞孵育后，都未见产生明显的荧光信号。结果表明，所筛选的Apt 23 可特异性地识别4T1细胞，与其表面的CRT有较强的结合，说明筛选的Apt 23可作为细胞水平的成像探针。

    4?结 论

    利用CE-SELEX法有效地筛选出靶向CRT的核酸适配体Apt 23，其对CRT具有良好的亲和力和特异性，可以识别血清基质中和乳腺癌细胞表面的CRT，因此可作为血清基质中CRT的检测探针和乳腺癌细胞的成像探针。

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