混合型饲料添加剂中1，8 -桉叶素和松油烯-4-醇含量检测方法研究
林茂发 黄永辉 胡朝阳 黄何何 高希
摘要：建立了同时检测茶树油混合型饲料添加剂中1，8-桉叶素和松油烯-4-醇含量的气相色谱方法。样品采用乙醇提取，经毛细管相色谱柱（ZB-35，30m×0.32mm×0.25um）分离，氢火焰离子化检测器测定，外标法定量，并采用气质确证。方法学研究结果表明，目标化合物1，8-桉叶素和松油烯-4-醇在0.01～10 mg/mL浓度范围内具有良好线性关系，相关系数为r≥0.9990，检出限分别为15mg/kg、10mg/kg;回收率为80.8～102.5%，相对标准偏差为2.23～4.57%。该方法简便、快捷，灵敏度和准确度均较高可以用于茶树油混合型饲料添加剂样品中1，8-桉叶素和松油烯-4-醇的测定。
关键词：茶树油;混合型饲料添加剂;1，8-桉叶素;松油烯-4-醇;气相色谱法;气质确证
养殖户在养殖过程中由于动物的疾病等原因可能使用各种抗生素，抗生素对动物的疾病等有一定的治疗效果，但是长期大量不合理使用会产生负作用。一方面经常喂养抗生素会破坏动物体肠道的有益菌群并使动物体内产生耐药菌株形成抗药性，降低动物的免疫能力，增大治疗和养殖难度。另一方面，抗生素类药物及其代谢物在动物体内经过富集.会导致畜禽鱼体产品兽药残留超标，近年来检测出的蛋类、畜禽肉类、鱼肉中抗生素及其代谢物超标，究其原因均为养殖户不合理使用抗生素引起的，畜禽鱼肉产品抗生素及其代谢物残留量一般极低，但长期食用，会对人体健康产生危害。因此开发新型的、高效、保障养殖产品安全、能够替代抗生素的饲料添加剂，对推动养殖业向健康养殖、无抗养殖，提高养殖产品安全，满足人们对食品安全需求，具有积极的意义。
经过多年的养殖实践表明，采用植物提取物或中药作为饲料添加剂对动物体不会产生毒害与残留及生抗药性而且可促进动物肌体生长，能够改善畜禽鱼肉的品质，可以长期拌料喂养，提高畜禽鱼的免疫力，采用养防并举，实现养殖业绿色，高效，环保可持续发展。目前，饲料添加剂企业利用我国植物及中草药丰富的资源大力开发植物提取物和中药类型的功能型饲料添加剂以取代抗生素的使用，养殖户也逐渐接受无抗养殖的理念。相对于市场上种类繁多的新型饲料添加剂，质量监管部门能提供的检测方法标准显得有些不足，因此，有必要加强该类新型饲料添加剂检测方法的开发与研究。
本实验研究对象为以互叶白千层茶树（MelaleucaAlternefolia Tea Tree）枝叶为原料生产的茶树油（Tea Tree oil，TTO）为活性物，以玉米淀粉为载体，以豆油（或同类型的植物油）为稀释剂按一定比例均匀混合制成的混合型饲料添加剂产品。茶树油是一种天然的植物提取精油，在日化、食品、医药、生物农药等方面有广泛的应用。由于茶树油具有广谱抗微生物，抑菌、杀菌、消炎、驱虫等功能，用于饲料添加剂可以治疗动物的某些疾病，提高动物的免疫能力，降低饵料系数及改善畜禽鱼肉的品质，是农业部《饲料添加剂品种目录（2013）》允许使用的饲料添加剂之一，是种替代抗生素的理想饲料添加剂。茶树油组成成分较为复杂，已经研究发现的化学分子有100多种，按照主要特征组分组成可分为三种类型，分别为：松油烯-4-醇型（松油烯-4-醇≥30%）、1，8-桉叶素型（1，8-桉叶素≥35%）和异松油烯型（异松油烯≥40%），国内市场上应用的主要为4-松油醇型和1，8-桉叶素型，我国茶树油作为饲料添加剂在养殖领域的应用已经有一定的研究，但对茶树油饲料添加剂的检测方法尚未见文献报道，本实验开发出气相色谱法（GC-FID）同时检测茶树油饲料添加剂中的特征组分松油烯-4-醇（terpinen-4-olcas no 562-74-3）和1，8-桉叶素（1，8-Cineolecas no 470-82-6）的检测方法，并对目标化合物采用气相色谱串联质谱法（ GC/MS）确证，实验证明该方法准确快捷，可以用于茶树油饲料添加剂的检测。
1 实验部分
1.1仪器与设备
气相色谱仪带自动进样系统联FID检测器及配套丁作站（日本SHIMADZU公司），石英毛细管柱（ZB-35，30m×0.32mm×0.25um）美国Agilent公司.6890N/5973N气相色谱-质谱联用仪，美国Agilent公司;ZB-35MS石英毛细柱（30m×0.25mm×0.25μm）美国Agilent公司，BT224S分析天平，德国Sartorius公司;XH-B旋涡混均器，江苏康健医疗用品有限公司;调速多用振荡器（上海研永超声设备有限公司）;高速冷冻离心机，Aanti J-E，美国BeckmanCoulter公司：具塞玻璃刻度管（10毫升，25毫升两种规格）;50ML具塞塑料离心管。
1.2材料与试剂
甲醇、乙醇、乙腈、丙酮均为分析纯，1，8-桉叶素标准品纯度大于99.0%（德国Dr.Ehrenstorfer公司），松油烯-4 -醇标准品纯度大于98%（德国Dr - Ehrenstorfer公司）。称取一定量的标准品，用无水乙醇溶解转移到容量瓶中，并逐级稀释成实验所需的的浓度。再配制成相应浓度的混标。
1.3方法
1.3.1色谱条件：进样口温度：260℃;色谱柱升温程序：50℃保留1min，10℃/min升至250℃，保留10min。检测器（FID）温度280℃，载气，氮气（纯度不小于99.999%）;燃氣，氢气（纯度不小于99.99%）;空气（压缩空气）;气体流量：柱流量，1.85mLmin;氢气40mL/min;空气400mL/min;尾吹气，30mL/min;进样量：1μL;分流比：50：1。
1.3.2样品前处理
准确称取样品1克（精确至0.0001g），置于塑料离心管中，用4ml无水乙醇旋涡混均溶解后，在振荡器上振摇3min后，于5000r/min条件下离心5 min，吸取上清液于玻璃刻度管中，重复上述操作一遍，再加入2ml无水乙醇重复上述操作一遍，定容，摇匀，置于-18℃条件下速冻1小时，过0.45um有机相滤膜后，上机检测。
1.3.3测定
在上述选定的气相色谱条件下，待仪器稳定后，进行标准溶液和试样溶液气相色谱分析。
2结果与分析
2.1 色谱方法条件的选择
分别取空白基质样品、茶树油混合饲料添加剂样品按上述前处理方法制备的溶液及混合标准品溶液，按1.3.1色谱条件测定。结果发现空白基质样品在目标化合物保留时间处无杂质峰干扰，见图二，图三和图四，表明样品基质中其他成分不干扰目标化合物测定，并且能够在最短的时间实现目标化合物完全分离，方法特异性强，适用于茶树油混合型饲料添加剂中1，8-桉叶素和松油烯一4-醇含量测定。
2.2方法的线性范围及检测限
将1，8-桉叶素、松油烯-4-醇系列标准溶液（0.01mg/ml～10.00mg/ml）加入空白基质中，在上述的气相色谱条件下进样分析，以标准溶液浓度为横坐标，对应的峰面积为纵坐标，拟合标准曲线，得到相应的线性同归方程及相关系数，根据3倍噪比计算方法的检测限，以10倍信噪比计算方法定量限。结果见表1
2.3 方法的回收率和精密度
向空白基质样品中分别添加Ⅰ（Sg/kg）、Ⅱ（10g/kg）、Ⅲ（50g/kg）三个浓度水平的混合标样，每个水平进行6次平行测定，同收率和精密度結果见表2。
2.4溶液稳定性试验
按上述的前处理方法制备样品溶液，样品溶液密封保存在室温环境中，隔2h、4h、8h、12h、24h、48h按前述方法测定（1，8-桉叶素1.00g/kg，松油烯-4-醇29.00g/kg）的含量，结果见表3，结果表明样品溶液在48h内稳定。
2.5 色谱柱的选择
影响色谱柱分离效果的一个重要因素是固定相类型，目标化合物的化学结构和极性是本实验主要考虑的因素，茶树油型饲料添加剂是以茶树油为活性物，以玉米淀粉为载体，以豆油（或同类型的植物油）为稀释剂按一定比例均匀混合制成的。因此选择色谱柱除了要考虑1，8-桉叶素、松油烯-4-醇的分子结构外，还要考虑茶树油和其它基质的干扰因素。本实验采用了3种不同极性的色谱柱，ZB-5、ZB-35及ZB-624毛细管色谱柱，综合考虑灵敏度，峰形，分析时间，基线漂移等色谱分析因素，ZB-35毛细管色谱柱效果最好，因此以ZB-35毛细管色谱柱作为本试验用色谱柱。
2.6柱温和柱流量的优化选择
由于茶树油除了1，8-桉叶素和松油烯-4-醇外还有其它的众多组分，有些组分和目标化合物的出峰时间较接近，在确定优选色谱柱后，气相色谱法中能够影响目标化合物分离效果的因素主要为色谱柱的升温程序和色谱柱的气体流量。本研究反复实验比较了不同的初始温度、升温速率、柱流量后，确定仪器参数为：进样口温度：260℃;色谱柱升温程序：500℃保留1min，10℃ /min升至250℃，保留10min。检测器（FID）温度280℃。气体流量：柱流量，2.00mL/min;氢气48mL/min;空气480mL/min;尾吹气，30mL/min。
2.7提取溶剂的选择
本研究实验采用了甲醇、乙醇、乙腈、丙酮作为样品的提取溶剂，实验表明丙酮提取物杂质较多，对目标化合物的定性容易生产的干扰。而甲醇，乙醇、乙腈这3种溶剂均能很好地提取目标化合物，由于乙醇较其他溶剂毒性小，价格便宜，对环境无毒害，所以本研究实验选择无水乙醇作为提取溶剂。
3 GC/M确证
在空白基质中添加浓度为10g/kg水平的混标，按1.3.2进行前处理。
质谱条件：载气为高纯氦气，流速为2.0ml/min;采用分流进样，分流比为50：1;进样口温度为260℃，初始温度为50℃，以10℃/min升至200℃保持10min，离子源为EI源;电子能量为70eV;传输线温度270℃;离子源温度230℃;四级杆温度150℃;溶剂延迟3min。采用Scan扫描模式，m/z质量扫描的范围为50～500 m/z。总离子流图和质谱图见图五和图六。
4实际样品测定
对企业生产的茶树油混合型饲料添加剂进行测定，准确称取样品1克（精确至0.0001g），按1.3.2进行前处理。采用GC-FID测定，色谱谱图见图七，测定结果与产品明示值相符。
5结论
本研究建立了茶树油混合型饲料添加剂中1，8-桉叶素和松油烯-4-醇的气相色谱法测定方法，能够实现简单的样品前处理和高通量检测，方法特异性强并且具有较宽的线性范围，十分显著的线性关系、加标回收率高、重现性好的优点;使用仪器设备普及率高，可在茶树油混合型饲料添加剂中1，8-桉叶素和松油烯-4-醇的质量检测及标准制定中加以推广应用。
参考文献（略）
摘要：建立了同时检测茶树油混合型饲料添加剂中1，8-桉叶素和松油烯-4-醇含量的气相色谱方法。样品采用乙醇提取，经毛细管相色谱柱（ZB-35，30m×0.32mm×0.25um）分离，氢火焰离子化检测器测定，外标法定量，并采用气质确证。方法学研究结果表明，目标化合物1，8-桉叶素和松油烯-4-醇在0.01～10 mg/mL浓度范围内具有良好线性关系，相关系数为r≥0.9990，检出限分别为15mg/kg、10mg/kg;回收率为80.8～102.5%，相对标准偏差为2.23～4.57%。该方法简便、快捷，灵敏度和准确度均较高可以用于茶树油混合型饲料添加剂样品中1，8-桉叶素和松油烯-4-醇的测定。
关键词：茶树油;混合型饲料添加剂;1，8-桉叶素;松油烯-4-醇;气相色谱法;气质确证
养殖户在养殖过程中由于动物的疾病等原因可能使用各种抗生素，抗生素对动物的疾病等有一定的治疗效果，但是长期大量不合理使用会产生负作用。一方面经常喂养抗生素会破坏动物体肠道的有益菌群并使动物体内产生耐药菌株形成抗药性，降低动物的免疫能力，增大治疗和养殖难度。另一方面，抗生素类药物及其代谢物在动物体内经过富集.会导致畜禽鱼体产品兽药残留超标，近年来检测出的蛋类、畜禽肉类、鱼肉中抗生素及其代谢物超标，究其原因均为养殖户不合理使用抗生素引起的，畜禽鱼肉产品抗生素及其代谢物残留量一般极低，但长期食用，会对人体健康产生危害。因此开发新型的、高效、保障养殖产品安全、能够替代抗生素的饲料添加剂，对推动养殖业向健康养殖、无抗养殖，提高养殖产品安全，满足人们对食品安全需求，具有积极的意义。
经过多年的养殖实践表明，采用植物提取物或中药作为饲料添加剂对动物体不会产生毒害与残留及生抗药性而且可促进动物肌体生长，能够改善畜禽鱼肉的品质，可以长期拌料喂养，提高畜禽鱼的免疫力，采用养防并举，实现养殖业绿色，高效，环保可持续发展。目前，饲料添加剂企业利用我国植物及中草药丰富的资源大力开发植物提取物和中药类型的功能型饲料添加剂以取代抗生素的使用，养殖户也逐渐接受无抗养殖的理念。相对于市场上种类繁多的新型饲料添加剂，质量监管部门能提供的检测方法标准显得有些不足，因此，有必要加强该类新型饲料添加剂检测方法的开发与研究。
本实验研究对象为以互叶白千层茶树（MelaleucaAlternefolia Tea Tree）枝叶为原料生产的茶树油（Tea Tree oil，TTO）为活性物，以玉米淀粉为载体，以豆油（或同类型的植物油）为稀释剂按一定比例均匀混合制成的混合型饲料添加剂产品。茶树油是一种天然的植物提取精油，在日化、食品、医药、生物农药等方面有广泛的应用。由于茶树油具有广谱抗微生物，抑菌、杀菌、消炎、驱虫等功能，用于饲料添加剂可以治疗动物的某些疾病，提高动物的免疫能力，降低饵料系数及改善畜禽鱼肉的品质，是农业部《饲料添加剂品种目录（2013）》允许使用的饲料添加剂之一，是种替代抗生素的理想饲料添加剂。茶树油组成成分较为复杂，已经研究发现的化学分子有100多种，按照主要特征组分组成可分为三种类型，分别为：松油烯-4-醇型（松油烯-4-醇≥30%）、1，8-桉叶素型（1，8-桉叶素≥35%）和异松油烯型（异松油烯≥40%），国内市场上应用的主要为4-松油醇型和1，8-桉叶素型，我国茶树油作为饲料添加剂在养殖领域的应用已经有一定的研究，但对茶树油饲料添加剂的检测方法尚未见文献报道，本实验开发出气相色谱法（GC-FID）同时检测茶树油饲料添加剂中的特征组分松油烯-4-醇（terpinen-4-olcas no 562-74-3）和1，8-桉叶素（1，8-Cineolecas no 470-82-6）的检测方法，并对目标化合物采用气相色谱串联质谱法（ GC/MS）确证，实验证明该方法准确快捷，可以用于茶树油饲料添加剂的检测。
1 实验部分
1.1仪器与设备
气相色谱仪带自动进样系统联FID检测器及配套丁作站（日本SHIMADZU公司），石英毛细管柱（ZB-35，30m×0.32mm×0.25um）美国Agilent公司.6890N/5973N气相色谱-质谱联用仪，美国Agilent公司;ZB-35MS石英毛细柱（30m×0.25mm×0.25μm）美国Agilent公司，BT224S分析天平，德国Sartorius公司;XH-B旋涡混均器，江苏康健医疗用品有限公司;调速多用振荡器（上海研永超声设备有限公司）;高速冷冻离心机，Aanti J-E，美国BeckmanCoulter公司：具塞玻璃刻度管（10毫升，25毫升两种规格）;50ML具塞塑料离心管。
1.2材料与试剂
甲醇、乙醇、乙腈、丙酮均为分析纯，1，8-桉叶素标准品纯度大于99.0%（德国Dr.Ehrenstorfer公司），松油烯-4 -醇标准品纯度大于98%（德国Dr - Ehrenstorfer公司）。称取一定量的标准品，用无水乙醇溶解转移到容量瓶中，并逐级稀释成实验所需的的浓度。再配制成相应浓度的混标。
1.3方法
1.3.1色谱条件：进样口温度：260℃;色谱柱升温程序：50℃保留1min，10℃/min升至250℃，保留10min。检测器（FID）温度280℃，载气，氮气（纯度不小于99.999%）;燃氣，氢气（纯度不小于99.99%）;空气（压缩空气）;气体流量：柱流量，1.85mLmin;氢气40mL/min;空气400mL/min;尾吹气，30mL/min;进样量：1μL;分流比：50：1。
1.3.2样品前处理
准确称取样品1克（精确至0.0001g），置于塑料离心管中，用4ml无水乙醇旋涡混均溶解后，在振荡器上振摇3min后，于5000r/min条件下离心5 min，吸取上清液于玻璃刻度管中，重复上述操作一遍，再加入2ml无水乙醇重复上述操作一遍，定容，摇匀，置于-18℃条件下速冻1小时，过0.45um有机相滤膜后，上机检测。
1.3.3测定
在上述选定的气相色谱条件下，待仪器稳定后，进行标准溶液和试样溶液气相色谱分析。
2结果与分析
2.1 色谱方法条件的选择
分别取空白基质样品、茶树油混合饲料添加剂样品按上述前处理方法制备的溶液及混合标准品溶液，按1.3.1色谱条件测定。结果发现空白基质样品在目标化合物保留时间处无杂质峰干扰，见图二，图三和图四，表明样品基质中其他成分不干扰目标化合物测定，并且能够在最短的时间实现目标化合物完全分离，方法特异性强，适用于茶树油混合型饲料添加剂中1，8-桉叶素和松油烯一4-醇含量测定。
2.2方法的线性范围及检测限
将1，8-桉叶素、松油烯-4-醇系列标准溶液（0.01mg/ml～10.00mg/ml）加入空白基质中，在上述的气相色谱条件下进样分析，以标准溶液浓度为横坐标，对应的峰面积为纵坐标，拟合标准曲线，得到相应的线性同归方程及相关系数，根据3倍噪比计算方法的检测限，以10倍信噪比计算方法定量限。结果见表1
2.3 方法的回收率和精密度
向空白基质样品中分别添加Ⅰ（Sg/kg）、Ⅱ（10g/kg）、Ⅲ（50g/kg）三个浓度水平的混合标样，每个水平进行6次平行测定，同收率和精密度結果见表2。
2.4溶液稳定性试验
按上述的前处理方法制备样品溶液，样品溶液密封保存在室温环境中，隔2h、4h、8h、12h、24h、48h按前述方法测定（1，8-桉叶素1.00g/kg，松油烯-4-醇29.00g/kg）的含量，结果见表3，结果表明样品溶液在48h内稳定。
2.5 色谱柱的选择
影响色谱柱分离效果的一个重要因素是固定相类型，目标化合物的化学结构和极性是本实验主要考虑的因素，茶树油型饲料添加剂是以茶树油为活性物，以玉米淀粉为载体，以豆油（或同类型的植物油）为稀释剂按一定比例均匀混合制成的。因此选择色谱柱除了要考虑1，8-桉叶素、松油烯-4-醇的分子结构外，还要考虑茶树油和其它基质的干扰因素。本实验采用了3种不同极性的色谱柱，ZB-5、ZB-35及ZB-624毛细管色谱柱，综合考虑灵敏度，峰形，分析时间，基线漂移等色谱分析因素，ZB-35毛细管色谱柱效果最好，因此以ZB-35毛细管色谱柱作为本试验用色谱柱。
2.6柱温和柱流量的优化选择
由于茶树油除了1，8-桉叶素和松油烯-4-醇外还有其它的众多组分，有些组分和目标化合物的出峰时间较接近，在确定优选色谱柱后，气相色谱法中能够影响目标化合物分离效果的因素主要为色谱柱的升温程序和色谱柱的气体流量。本研究反复实验比较了不同的初始温度、升温速率、柱流量后，确定仪器参数为：进样口温度：260℃;色谱柱升温程序：500℃保留1min，10℃ /min升至250℃，保留10min。检测器（FID）温度280℃。气体流量：柱流量，2.00mL/min;氢气48mL/min;空气480mL/min;尾吹气，30mL/min。
2.7提取溶剂的选择
本研究实验采用了甲醇、乙醇、乙腈、丙酮作为样品的提取溶剂，实验表明丙酮提取物杂质较多，对目标化合物的定性容易生产的干扰。而甲醇，乙醇、乙腈这3种溶剂均能很好地提取目标化合物，由于乙醇较其他溶剂毒性小，价格便宜，对环境无毒害，所以本研究实验选择无水乙醇作为提取溶剂。
3 GC/M确证
在空白基质中添加浓度为10g/kg水平的混标，按1.3.2进行前处理。
质谱条件：载气为高纯氦气，流速为2.0ml/min;采用分流进样，分流比为50：1;进样口温度为260℃，初始温度为50℃，以10℃/min升至200℃保持10min，离子源为EI源;电子能量为70eV;传输线温度270℃;离子源温度230℃;四级杆温度150℃;溶剂延迟3min。采用Scan扫描模式，m/z质量扫描的范围为50～500 m/z。总离子流图和质谱图见图五和图六。
4实际样品测定
对企业生产的茶树油混合型饲料添加剂进行测定，准确称取样品1克（精确至0.0001g），按1.3.2进行前处理。采用GC-FID测定，色谱谱图见图七，测定结果与产品明示值相符。
5结论
本研究建立了茶树油混合型饲料添加剂中1，8-桉叶素和松油烯-4-醇的气相色谱法测定方法，能够实现简单的样品前处理和高通量检测，方法特异性强并且具有较宽的线性范围，十分显著的线性关系、加标回收率高、重现性好的优点;使用仪器设备普及率高，可在茶树油混合型饲料添加剂中1，8-桉叶素和松油烯-4-醇的质量检测及标准制定中加以推广应用。
参考文献（略）
