闭合蛋白Occludin在畜禽肠道屏障中的调节作用
方成堃+何邵平+贺建华
摘要：肠道是动物消化食物、吸收营养的主要场所。闭合蛋白Occludin作为细胞紧密连接的重要组成部分，发挥封闭细胞间隙、形成机体渗透屏障、保持细胞两侧物质差异的作用。本文综述了闭合蛋白Occludin在调控畜禽肠道健康中的作用及影响其蛋白表达的一些因素。
关键词：闭合蛋白；肠道健康；调控作用
小肠是动物吸收营养物质的主要场所。但是，由于各种外界因素的应激，使得动物常常出现食欲差、消化功能紊乱等问题，从而导致肠道屏障受损，肠绒毛萎缩，隐窝深度加大，进而出现腹泻和生长缓慢的现象。作为上皮细胞间连接的一种主要形式，紧密连接（Tight Junction）对维护上皮细胞两侧物质的差异和保持细胞极性起着重要的作用。紧密连接是由一系列跨膜蛋白和外周蛋白相互作用而形成的一个复杂的蛋白质体系，能被多种方式所调控。闭合蛋白是其中最重要的蛋白质分子之一，上皮细胞通过Occludin蛋白封闭细胞间隙，并与ZO-1等结合形成紧密连接的基础结构。Occludin蛋白功能状态与多种疾病的发生、发展相关，有着重要的临床意义。
1闭合蛋白Occludin的结构
闭合蛋白（Occludin）最早是由Furuse等发现的，其定位于鸡肝紧密连接的膜内在蛋白，由504个氨基酸残基组成，相对分子质量是64×103，另有4个跨膜结构域。氨基端和羧基端均位于细胞质区，2个富含丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸残基的细胞外环，一个由10个氨基酸残基组成的细胞内环。在N-端，氨基截短的闭合蛋白Occludin可精确地结合到紧密连接上，并能与ZO-1相结合，但荧光示踪剂的通透性上升，无法维持较高的跨细胞电阻。研究表明，N-末端缩短的闭合蛋白Occludin位于小鼠上皮细胞系CSG120/7上。通过电生理学测定结果表明，N-末端缩短结构将对紧密连接的屏障功能产生不利影响。另有研究表明，在转染的狗的肾脏细胞中，C-末端缩短的闭合蛋白Occludin能够精确定位在紧密连接上。C-端截短的鸡闭合蛋白Occludin可被整合至紧密连接中，但会导致细胞间通透性的增加，导入正常的闭合蛋白Occludin的mRNA可纠正，在羧基段含有一个疏水（coiled-coil）结构域。这个结构域是与ZO-1的氨基端结合的位点，ZO-1的羧基段结构域再与细胞内骨架蛋白结合。Coiled-coil结构域也是磷脂酰肌醇-3（PI-3）激酶等调节蛋白作用的位点。
2闭合蛋白Occludin的功能
闭合蛋白Occludin的最主要功能是参与维持紧密连接的屏障功能，对Raf1介导的肿瘤发生有强烈的抑制作用。比如，在犬肾细胞系（MDCK）中过量表达的闭合蛋白Occludin会提高经上皮细胞的跨膜电阻，并且用合成肽模拟细胞外的闭合蛋白Occludin的循环结构被指出会其使正常的回路断裂从而使上皮细胞的通透新增加。在灭活鼠中试验中，研究者指出紧密连接具有复杂的表观组织学特征，即使上皮组织中有慢性炎症反应，但是紧密连接在形态学上是完整的，意味着在紧密连接中闭合蛋白Occludin有可能更多的是担任一个维持其稳定性和屏障功能的角色。同时指出，在皮层肌动蛋白组织和不同的内皮细胞模型的屏障功能中闭合蛋白Occludin是必不可少的。通过闭合蛋白Occludin可下调蛋白水解和透性化因素处理的血管内皮生长因子和磷脂酶，从而提高内皮细胞的通透性。
3闭合蛋白Occludin与畜禽肠道营养调控
3.1抗营养因子与闭合蛋白Occludin
大豆凝集素（SBA）是大豆抗营养因子中重要的一种，影响动物的肠道结构和功能，从而降低了动物对大豆蛋白的利用效率。SBA会显著性降低细胞间紧密连接occludin和claudin-3蛋白的相对表达量，降低肠道的机械屏障功能。另一研究表明：随大豆球蛋白浓度逐渐升高，仔猪小肠上皮细胞紧密连接蛋白Z0～1和闭合蛋白Occludin mRNA相对表达量均呈下降趋势。
3.2断奶应对闭合蛋白Occludin 表达的影响
仔猪早期断奶应激会引起小肠绒毛高度下降，隐窝深度加深，对断奶仔猪小肠形态造成损伤。仔猪早期断奶后肠上皮细胞紧密连接蛋白闭合蛋白Occludin mRNA相对表达量明显下降，至35日龄时虽有所恢复，但仍然低于断奶前表达水平。闭合蛋白Occludin一旦进入紧密连接，其连接部位的膜通透性降低，仅允许小分子出入，而大分子难以进出。它的存在决定肠道选择性屏障，一旦发生变异、减少和缺失可以引起肠上皮细胞间隙通透性增加，细菌内毒素等大分子物质可透过紧密连接进入体循环。早期断奶后仔猪肠道的通透性增加，肠屏障功能破坏，可能归因于肠上皮细胞紧密连接蛋白闭合蛋白Occludin mRNA表达下降。
3.3针对闭合蛋白Occludin的影响
在维持动物胃肠道上皮屏障的功能完整性上，锌的作用已被广泛报道，由于锌的缺乏会导致紧密连接的改变，其对闭合蛋白Occludin也有一定的影响。高剂量氧化锌对肠屏障的保护作用并不是通过改变肠道菌群结构，而是通过抑制细菌在肠道黏膜的黏附，阻止上皮细胞渗透性的增加来实现的。以产肠毒素型埃希氏大肠杆菌（ETEC，K88）所导致的受损Caco-2细胞系作为模型，研究氧化锌对受损细胞的保护作用。结果表明，高剂量氧化锌增加了培养细胞系的细胞紧密连接渗透性，氧化锌可以阻止黏膜完整性遭到破坏。胡彩虹等的研究表明，高锌可以调节肠上皮细胞紧密连接蛋白闭合蛋白Occludin和ZO-l的表达，同时指出高锌影响闭合蛋白Occludin和ZO-l基因表达的作用是通过维护肠黏膜功能，减少细菌和内毒素通透和其对某些细胞因子的调控产生作用实现的。
3.4微生态剂对闭合蛋白Occludin的影响
目前认为肠道致病菌影响紧密连接功能的途径：（1）改变宿主细胞紧密连接蛋白结构及功能；（2）破坏细胞骨架结构；（3）影响其他细胞信号通路，如PKC途径等。姜伟炜等的研究显示，大肠杆菌黏附于肠道上皮细胞后，可分泌效应分子，并通过各种途径作用于细胞，引起肠黏膜功能紊乱，如电解质分泌紊乱，紧密连接屏障被破坏，细菌异位感染等，或诱导细胞凋亡。在陈德龙等的试验结果中表明，在LAB1模拟治疗S.cho和E.coli感染的试验中，闭合蛋白Occludin的表达量与LAB1浓度有很强的正浓度效应，和S.cho与E.coli感染量呈负浓度效应。同时，Shin等的研究中发现，肠道致病性大肠杆菌可使闭合蛋白Occludin去磷酸化，导致闭合蛋白Occludin位置改变，跨膜电阻值降低。
抗菌肽，又称微生物肽，是一类具有抗菌、抗病毒活性的小分子多肽。在猪的空肠上皮细胞培养液中加入抗菌肽培养24小时，发现含5.0ug/mL以上的抗菌肽的培养基中，闭合蛋白Occludin基因相对表达量有上升趋势。有研究表明肠上皮细胞紧密连接蛋白的基因表达与肠道细菌的代谢产物（如磷壁酸、丁酸等）有关。因此，抗菌肽可维持肠道微生态平衡，提高肠粘膜免疫力，间接促进闭合但的基因表达。
3.5谷氨酰胺对闭合蛋白Occludin的影响
谷氨酰胺（glutamine，Gln）是胃肠道管腔细胞的基本能量来源，是肠道粘膜细胞代谢必需的营养物质，对维持肠道粘膜上皮结构的完整性起着十分重要的作用。已有研究报道在肠细胞培养液中抑制谷氨酰胺合酶活性或不添加谷氨酰胺时，甘露醇渗透性增加，跨上皮电阻抗值下降，从而减少闭合蛋白Occludin表达并扰乱其分布，引起肠道屏障功能的损伤。近年研究表明，信号通路ERK和NF-κB与调控闭合蛋白修复肠道屏障损伤有关。
4小结
黏膜屏障是肠道重要的屏障之一，其由上皮细胞以及细胞间的众多连接所构成如紧密连接、缝隙连接（gapjunction，GJ）、点附连接（adherencejunction，AJ）以及桥粒（desmosome）等。紧密连接主要位于细胞顶端表面，是上皮细胞间连接最为重要的结构复合物，在维持肠粘膜的屏障功能方面发挥重要的作用，闭合蛋白Occludin对维持上皮细胞极性，形成机体渗透屏障具有重要的作用。虽然关于闭合蛋白结构、功能和调控机制已经进行了部分的研究，但是从营养的角度，研究食物或饲料中某种物质对机体闭合蛋白结构和表达等方面的影响可以为深入揭示闭合蛋白功能提供数据支持，并且从生理、病例变化中研究其结构的改变，为研究闭合蛋白Occludin在调控动物肠道营养中的应用提供重要的理论基础。
摘要：肠道是动物消化食物、吸收营养的主要场所。闭合蛋白Occludin作为细胞紧密连接的重要组成部分，发挥封闭细胞间隙、形成机体渗透屏障、保持细胞两侧物质差异的作用。本文综述了闭合蛋白Occludin在调控畜禽肠道健康中的作用及影响其蛋白表达的一些因素。
关键词：闭合蛋白；肠道健康；调控作用
小肠是动物吸收营养物质的主要场所。但是，由于各种外界因素的应激，使得动物常常出现食欲差、消化功能紊乱等问题，从而导致肠道屏障受损，肠绒毛萎缩，隐窝深度加大，进而出现腹泻和生长缓慢的现象。作为上皮细胞间连接的一种主要形式，紧密连接（Tight Junction）对维护上皮细胞两侧物质的差异和保持细胞极性起着重要的作用。紧密连接是由一系列跨膜蛋白和外周蛋白相互作用而形成的一个复杂的蛋白质体系，能被多种方式所调控。闭合蛋白是其中最重要的蛋白质分子之一，上皮细胞通过Occludin蛋白封闭细胞间隙，并与ZO-1等结合形成紧密连接的基础结构。Occludin蛋白功能状态与多种疾病的发生、发展相关，有着重要的临床意义。
1闭合蛋白Occludin的结构
闭合蛋白（Occludin）最早是由Furuse等发现的，其定位于鸡肝紧密连接的膜内在蛋白，由504个氨基酸残基组成，相对分子质量是64×103，另有4个跨膜结构域。氨基端和羧基端均位于细胞质区，2个富含丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸残基的细胞外环，一个由10个氨基酸残基组成的细胞内环。在N-端，氨基截短的闭合蛋白Occludin可精确地结合到紧密连接上，并能与ZO-1相结合，但荧光示踪剂的通透性上升，无法维持较高的跨细胞电阻。研究表明，N-末端缩短的闭合蛋白Occludin位于小鼠上皮细胞系CSG120/7上。通过电生理学测定结果表明，N-末端缩短结构将对紧密连接的屏障功能产生不利影响。另有研究表明，在转染的狗的肾脏细胞中，C-末端缩短的闭合蛋白Occludin能够精确定位在紧密连接上。C-端截短的鸡闭合蛋白Occludin可被整合至紧密连接中，但会导致细胞间通透性的增加，导入正常的闭合蛋白Occludin的mRNA可纠正，在羧基段含有一个疏水（coiled-coil）结构域。这个结构域是与ZO-1的氨基端结合的位点，ZO-1的羧基段结构域再与细胞内骨架蛋白结合。Coiled-coil结构域也是磷脂酰肌醇-3（PI-3）激酶等调节蛋白作用的位点。
2闭合蛋白Occludin的功能
闭合蛋白Occludin的最主要功能是参与维持紧密连接的屏障功能，对Raf1介导的肿瘤发生有强烈的抑制作用。比如，在犬肾细胞系（MDCK）中过量表达的闭合蛋白Occludin会提高经上皮细胞的跨膜电阻，并且用合成肽模拟细胞外的闭合蛋白Occludin的循环结构被指出会其使正常的回路断裂从而使上皮细胞的通透新增加。在灭活鼠中试验中，研究者指出紧密连接具有复杂的表观组织学特征，即使上皮组织中有慢性炎症反应，但是紧密连接在形态学上是完整的，意味着在紧密连接中闭合蛋白Occludin有可能更多的是担任一个维持其稳定性和屏障功能的角色。同时指出，在皮层肌动蛋白组织和不同的内皮细胞模型的屏障功能中闭合蛋白Occludin是必不可少的。通过闭合蛋白Occludin可下调蛋白水解和透性化因素处理的血管内皮生长因子和磷脂酶，从而提高内皮细胞的通透性。
3闭合蛋白Occludin与畜禽肠道营养调控
3.1抗营养因子与闭合蛋白Occludin
大豆凝集素（SBA）是大豆抗营养因子中重要的一种，影响动物的肠道结构和功能，从而降低了动物对大豆蛋白的利用效率。SBA会显著性降低细胞间紧密连接occludin和claudin-3蛋白的相对表达量，降低肠道的机械屏障功能。另一研究表明：随大豆球蛋白浓度逐渐升高，仔猪小肠上皮细胞紧密连接蛋白Z0～1和闭合蛋白Occludin mRNA相对表达量均呈下降趋势。
3.2断奶应对闭合蛋白Occludin 表达的影响
仔猪早期断奶应激会引起小肠绒毛高度下降，隐窝深度加深，对断奶仔猪小肠形态造成损伤。仔猪早期断奶后肠上皮细胞紧密连接蛋白闭合蛋白Occludin mRNA相对表达量明显下降，至35日龄时虽有所恢复，但仍然低于断奶前表达水平。闭合蛋白Occludin一旦进入紧密连接，其连接部位的膜通透性降低，仅允许小分子出入，而大分子难以进出。它的存在决定肠道选择性屏障，一旦发生变异、减少和缺失可以引起肠上皮细胞间隙通透性增加，细菌内毒素等大分子物质可透过紧密连接进入体循环。早期断奶后仔猪肠道的通透性增加，肠屏障功能破坏，可能归因于肠上皮细胞紧密连接蛋白闭合蛋白Occludin mRNA表达下降。
3.3针对闭合蛋白Occludin的影响
在维持动物胃肠道上皮屏障的功能完整性上，锌的作用已被广泛报道，由于锌的缺乏会导致紧密连接的改变，其对闭合蛋白Occludin也有一定的影响。高剂量氧化锌对肠屏障的保护作用并不是通过改变肠道菌群结构，而是通过抑制细菌在肠道黏膜的黏附，阻止上皮细胞渗透性的增加来实现的。以产肠毒素型埃希氏大肠杆菌（ETEC，K88）所导致的受损Caco-2细胞系作为模型，研究氧化锌对受损细胞的保护作用。结果表明，高剂量氧化锌增加了培养细胞系的细胞紧密连接渗透性，氧化锌可以阻止黏膜完整性遭到破坏。胡彩虹等的研究表明，高锌可以调节肠上皮细胞紧密连接蛋白闭合蛋白Occludin和ZO-l的表达，同时指出高锌影响闭合蛋白Occludin和ZO-l基因表达的作用是通过维护肠黏膜功能，减少细菌和内毒素通透和其对某些细胞因子的调控产生作用实现的。
3.4微生态剂对闭合蛋白Occludin的影响
目前认为肠道致病菌影响紧密连接功能的途径：（1）改变宿主细胞紧密连接蛋白结构及功能；（2）破坏细胞骨架结构；（3）影响其他细胞信号通路，如PKC途径等。姜伟炜等的研究显示，大肠杆菌黏附于肠道上皮细胞后，可分泌效应分子，并通过各种途径作用于细胞，引起肠黏膜功能紊乱，如电解质分泌紊乱，紧密连接屏障被破坏，细菌异位感染等，或诱导细胞凋亡。在陈德龙等的试验结果中表明，在LAB1模拟治疗S.cho和E.coli感染的试验中，闭合蛋白Occludin的表达量与LAB1浓度有很强的正浓度效应，和S.cho与E.coli感染量呈负浓度效应。同时，Shin等的研究中发现，肠道致病性大肠杆菌可使闭合蛋白Occludin去磷酸化，导致闭合蛋白Occludin位置改变，跨膜电阻值降低。
抗菌肽，又称微生物肽，是一类具有抗菌、抗病毒活性的小分子多肽。在猪的空肠上皮细胞培养液中加入抗菌肽培养24小时，发现含5.0ug/mL以上的抗菌肽的培养基中，闭合蛋白Occludin基因相对表达量有上升趋势。有研究表明肠上皮细胞紧密连接蛋白的基因表达与肠道细菌的代谢产物（如磷壁酸、丁酸等）有关。因此，抗菌肽可维持肠道微生态平衡，提高肠粘膜免疫力，间接促进闭合但的基因表达。
3.5谷氨酰胺对闭合蛋白Occludin的影响
谷氨酰胺（glutamine，Gln）是胃肠道管腔细胞的基本能量来源，是肠道粘膜细胞代谢必需的营养物质，对维持肠道粘膜上皮结构的完整性起着十分重要的作用。已有研究报道在肠细胞培养液中抑制谷氨酰胺合酶活性或不添加谷氨酰胺时，甘露醇渗透性增加，跨上皮电阻抗值下降，从而减少闭合蛋白Occludin表达并扰乱其分布，引起肠道屏障功能的损伤。近年研究表明，信号通路ERK和NF-κB与调控闭合蛋白修复肠道屏障损伤有关。
4小结
黏膜屏障是肠道重要的屏障之一，其由上皮细胞以及细胞间的众多连接所构成如紧密连接、缝隙连接（gapjunction，GJ）、点附连接（adherencejunction，AJ）以及桥粒（desmosome）等。紧密连接主要位于细胞顶端表面，是上皮细胞间连接最为重要的结构复合物，在维持肠粘膜的屏障功能方面发挥重要的作用，闭合蛋白Occludin对维持上皮细胞极性，形成机体渗透屏障具有重要的作用。虽然关于闭合蛋白结构、功能和调控机制已经进行了部分的研究，但是从营养的角度，研究食物或饲料中某种物质对机体闭合蛋白结构和表达等方面的影响可以为深入揭示闭合蛋白功能提供数据支持，并且从生理、病例变化中研究其结构的改变，为研究闭合蛋白Occludin在调控动物肠道营养中的应用提供重要的理论基础。
