纸片快速法与固定底物酶底物法测定环境水样中粪大肠菌群（耐热大肠菌群）的比较
傅德瑜+高倩倩+高韦韦
摘要：粪大肠菌群是环境水体中是否受到粪便污染的重要指标，纸片快速法和固定底物酶底物法是当今环境监测广泛采用的方法，采用两种方法分别对标准菌株和实际水样进行检测，结果表明，纸片快速法和固定底物酶底物法用于粪大肠菌群的检测结果具有一致性。
关键词：纸片快速法；固定底物酶底物法；粪大肠菌群环境监测精密度
中图分类号：P332 文献标识码：A 文章编号：2095-672X（2017）03-0184-02
DOI：10.16647/j.cnki.cn15-1369/X.2017.03.099
Abstract： Fecal coliforms are an important indicator of whether fecal contamination is caused by fecal water in the environment. The rapid method and the method of fixed substrate enzyme are widely used in environmental monitoring. Two methods are used to compare the standard strains and the actual water The results showed that the results of rapid method and fixed substrate enzyme method for fecal coliform bacteria were consistent.
Key words： paper fast method； fixed substrate enzyme substrate method； fecal coliform bacteria environmental monitoring precision
粪大肠菌群是总大肠菌群中的一部分，主要来自粪便。粪大肠菌群就是一种大肠菌群，这种大肠菌群温度控制在44.5℃时能长出乳糖产酸产气并且发酵。利用改变温度的培养方式，以制造一种对自然环境不适应的大肠菌群生长的条件，不利的自然环境条件，培养细菌主要来自粪便大肠杆菌细菌，以便更准确地反映粪便污染水质的情况。目前针对环境水样监测指标中的粪大肠菌群（耐热大肠菌群）检测，方法主要有纸片快速法、固定底物酶底物法和传统的多管发酵法及滤膜法，此四种方法被环境检测部门广泛采用，多管发酵法和滤膜法检测时间较长，试验步骤繁琐，需验证试验，不能对水的卫生状况做出快速评价。纸片快速法、固定底物酶底物法操作简单，检测时间短，准确度高，但是固定底物酶底物法成本较高，而且未列入国标，纸片快速法列入环保行业标准方法（HJ/T 755-2015），现就纸片快速法和固定底物酶底物法做以下探讨。
1 方法原理
1.1 纸片快速法原理
按MPN法，将一定量的水样以无菌操作的方式接种到吸附有适量指示剂（溴甲酚紫和2，3，5-氯化三苯基四氮唑即TTC）以及乳糖等营养成分的无菌滤纸上，在特定的温度（37oC或44.5oC）培养24h，当细菌生长繁殖时，产酸使pH值降低，溴甲酚紫指示剂由紫色变黄色，同时，气体产生过程相应的合适的pH值范围内，脱氢酶催化脱氢还原TTC形式红三苯不溶性甲咱（ttf），之后可以产生酸黄色背景显示红点（或液体）。通过以上的颜色变化指标来判断是否产生酸产生气体，以确定是否存在粪大肠菌群，检查通过或然数表可以得出相应的粪便大肠杆菌细菌密度[1-2]。
1.2 固定底物酶底物法原理
根据大肠菌群能产生特异性的β-半乳糖苷酶（β-D-galactosidase）分解MMO-MUG培养基中的色原底物ONPG（Ortho-nitropheny1-β-D-glucuronide）使培养液呈黄色，以及大肠埃希氏菌产生特异性的β-葡萄糖酸酶（β-glucuronidase）分解MMO-MUG培养基中的荧光底物MUG（4-methy1-umbelliferyl-β- D-glucuronide）使培养液在波长366nm紫外光下产生荧光的原理，来判断水样中是否含大肠菌群、粪大肠菌群（耐热大肠菌群）及大肠埃希氏菌。
2 材料与方法
2.1 试剂和材料
纸片快速法：水质（粪）大肠菌群快速检测纸片（广州绿洲生化科技股份有限公司，型号为BD105I和BD105II）、无菌水。其它试剂按照《水质总大肠菌群和粪大肠菌群的测定纸片快速法》（HJ/T 755-2015）准备。
固定底物酶底物法：科立得（Colilert）试剂、IDEXX 97孔定量盘、IDEXX智能封口机。
标准菌株采用科立得IDEXX-QC Fecal Coliform质控标样（产品编号98-29001-00，Lot # 122815）。
2.2 方法
2.2.1 纸片快速法检测水中粪大肠菌群方法
根据《水质总大肠菌群和粪大肠菌群的测定纸片快速法》（HJ/T 755-2015）方法上的接种参考表，对清洁水样，接种水样总量为55.5ml，大纸片5张，每张接种10ml水样，小纸片10张，其中5张各接种水样1ml，另5张各接种1：10的稀释水样1ml；受污染水样，接种3个不同稀释度的1ml稀释水样各5张。接种后的水样纸片在44.5oC±0.5oC的条件中培养18～24h后观察结果。并同步做空白对照。根据纸片变色程度判断是否为阳性，查MPN表得到该水样的MPN值，经计算后可得出被测水样的粪大腸菌群浓度。
2.2.2 固定底物酶底物法（Colilert法）测水中粪大肠菌群采用97孔定量盘法
本方法取水样100ml，装入100ml的无菌瓶，加入科立得试剂，摇匀使其全部溶解，转入97孔无菌定量盘内，用手抚平定量盘赶出气泡，放入封口机封口。然后放入44.5℃±0.2℃培养箱中培养24h后进行结果判读，如果结果为可疑阴性，可适当延长培养时间到28h，超过28h之后出现的颜色反应不作为阳性结果。将培养24h之后的定量盘取出观察，如果孔穴内的水样变成黄色则表示该孔穴中含有粪大肠菌群（耐热大肠菌群）。计算黄色的孔穴数，对照MPN表查出其代表的粪大肠菌群（耐热大肠菌群）最可能数。
采用Excel软件进行实验数据整理和统计。
3 试验结果和分析
3.1 精密度和准确度检验
采用科立得IDEXX-QC Fecal Coliform质控标样（产品编号98-29001-00，Lot # 122815），分别用快速纸片法和固定底物酶底物法进行平行双样的分析，所得结果均在标准证书所要求的可接受范围内（34-703 MPN/100ml），标准菌株均未出现假阳性或假阴性，相对标准偏差范围为3.2%～4.7%，相对误差范围为-4.2%～3.5%，均在受控范围内。
3.2 水样比对
采用快速纸片法和固定底物酶底物法对50份地表水和废水样品进行分析。为方便作图和统计，將检测结果取lg值来表示，两种方法所测得的粪大肠菌群结果lgMPN值见图1：
对两种方法所得的数据结果进行配对t检验，为了使两组数据成正态分布，先对数据进行取对数后再处理，结果如下：
由上表数据可以看出，相关系数r=0.9019，说明两组数据相关性很好，t=1.985，P值=0.285>0.05，说明两种方法结果差异没有显著意义，可以认为纸片快速法和固定底物酶底物法所得检验结果没有区别，等效。
4 讨论
由表1中检测结果数据可以看出，快速纸片法MPN值较固定底物酶底物法略低，主要原因是固定底物酶底物法的底物为邻硝基苯β-D-半乳吡喃糖苷（ONPG），能够诱导样品中的细菌产生β-半乳糖苷酶，而具有β-半乳糖苷酶是肠杆菌群的重要特征之一[3]，而粪大肠菌群属于肠杆菌群的一种，因此，检测结果会高于纸片快速法。
纸片快速法和固定底物酶底物法均有操作步骤简单，不需要进行确认实验，检测时间短等优点，但是在技术难易和检测费用两个方面来说，快速纸片法检测费用更低，只需购买检测纸片，而固定底物酶底物法需购置封口设备和样品瓶及昂贵的试剂。故纸片快速法更适合现阶段环境监测机构的检测需求。
注意事项：水样在实验前必须充分摇匀，以减少因菌群分布不均匀带来的差异影响。因为要确保实验结果的准确性，同时也是能方便统计，要求水样有一定的阳性检出率，同时，水样的MPN值应尽量控制在2400以内，因为MPN本身为统计得出，如样品中菌数MPN值大于2400，由于样品稀释造成的分配不均导致的差异会比不稀释的样品大很多。
参考文献
[1]朱培瑜，魏轲，固定底物酶底物法与多管发酵法和快速纸片法测定水中粪大肠菌群（耐热大肠菌群）的比较[J].四川环境，2014，33（2）：82.
[2]赵春霞，张哲海.等酶底物法监测环境水样大肠菌群的探讨[J].中国环境科学学术年会论文集，2009.
[3]赵春霞，张哲海.固定底物酶底物法与多管发酵法和纸片法监测环境水样大肠菌群的比较[J].环境监测管理与技术，2009，21（2）：31-32.
收稿日期：2017-05-12
作者简介：傅德瑜，女，2004年毕业于西南石油大学，环境工程专业工程师，研究方向为环境监测。
摘要：粪大肠菌群是环境水体中是否受到粪便污染的重要指标，纸片快速法和固定底物酶底物法是当今环境监测广泛采用的方法，采用两种方法分别对标准菌株和实际水样进行检测，结果表明，纸片快速法和固定底物酶底物法用于粪大肠菌群的检测结果具有一致性。
关键词：纸片快速法；固定底物酶底物法；粪大肠菌群环境监测精密度
中图分类号：P332 文献标识码：A 文章编号：2095-672X（2017）03-0184-02
DOI：10.16647/j.cnki.cn15-1369/X.2017.03.099
Abstract： Fecal coliforms are an important indicator of whether fecal contamination is caused by fecal water in the environment. The rapid method and the method of fixed substrate enzyme are widely used in environmental monitoring. Two methods are used to compare the standard strains and the actual water The results showed that the results of rapid method and fixed substrate enzyme method for fecal coliform bacteria were consistent.
Key words： paper fast method； fixed substrate enzyme substrate method； fecal coliform bacteria environmental monitoring precision
粪大肠菌群是总大肠菌群中的一部分，主要来自粪便。粪大肠菌群就是一种大肠菌群，这种大肠菌群温度控制在44.5℃时能长出乳糖产酸产气并且发酵。利用改变温度的培养方式，以制造一种对自然环境不适应的大肠菌群生长的条件，不利的自然环境条件，培养细菌主要来自粪便大肠杆菌细菌，以便更准确地反映粪便污染水质的情况。目前针对环境水样监测指标中的粪大肠菌群（耐热大肠菌群）检测，方法主要有纸片快速法、固定底物酶底物法和传统的多管发酵法及滤膜法，此四种方法被环境检测部门广泛采用，多管发酵法和滤膜法检测时间较长，试验步骤繁琐，需验证试验，不能对水的卫生状况做出快速评价。纸片快速法、固定底物酶底物法操作简单，检测时间短，准确度高，但是固定底物酶底物法成本较高，而且未列入国标，纸片快速法列入环保行业标准方法（HJ/T 755-2015），现就纸片快速法和固定底物酶底物法做以下探讨。
1 方法原理
1.1 纸片快速法原理
按MPN法，将一定量的水样以无菌操作的方式接种到吸附有适量指示剂（溴甲酚紫和2，3，5-氯化三苯基四氮唑即TTC）以及乳糖等营养成分的无菌滤纸上，在特定的温度（37oC或44.5oC）培养24h，当细菌生长繁殖时，产酸使pH值降低，溴甲酚紫指示剂由紫色变黄色，同时，气体产生过程相应的合适的pH值范围内，脱氢酶催化脱氢还原TTC形式红三苯不溶性甲咱（ttf），之后可以产生酸黄色背景显示红点（或液体）。通过以上的颜色变化指标来判断是否产生酸产生气体，以确定是否存在粪大肠菌群，检查通过或然数表可以得出相应的粪便大肠杆菌细菌密度[1-2]。
1.2 固定底物酶底物法原理
根据大肠菌群能产生特异性的β-半乳糖苷酶（β-D-galactosidase）分解MMO-MUG培养基中的色原底物ONPG（Ortho-nitropheny1-β-D-glucuronide）使培养液呈黄色，以及大肠埃希氏菌产生特异性的β-葡萄糖酸酶（β-glucuronidase）分解MMO-MUG培养基中的荧光底物MUG（4-methy1-umbelliferyl-β- D-glucuronide）使培养液在波长366nm紫外光下产生荧光的原理，来判断水样中是否含大肠菌群、粪大肠菌群（耐热大肠菌群）及大肠埃希氏菌。
2 材料与方法
2.1 试剂和材料
纸片快速法：水质（粪）大肠菌群快速检测纸片（广州绿洲生化科技股份有限公司，型号为BD105I和BD105II）、无菌水。其它试剂按照《水质总大肠菌群和粪大肠菌群的测定纸片快速法》（HJ/T 755-2015）准备。
固定底物酶底物法：科立得（Colilert）试剂、IDEXX 97孔定量盘、IDEXX智能封口机。
标准菌株采用科立得IDEXX-QC Fecal Coliform质控标样（产品编号98-29001-00，Lot # 122815）。
2.2 方法
2.2.1 纸片快速法检测水中粪大肠菌群方法
根据《水质总大肠菌群和粪大肠菌群的测定纸片快速法》（HJ/T 755-2015）方法上的接种参考表，对清洁水样，接种水样总量为55.5ml，大纸片5张，每张接种10ml水样，小纸片10张，其中5张各接种水样1ml，另5张各接种1：10的稀释水样1ml；受污染水样，接种3个不同稀释度的1ml稀释水样各5张。接种后的水样纸片在44.5oC±0.5oC的条件中培养18～24h后观察结果。并同步做空白对照。根据纸片变色程度判断是否为阳性，查MPN表得到该水样的MPN值，经计算后可得出被测水样的粪大腸菌群浓度。
2.2.2 固定底物酶底物法（Colilert法）测水中粪大肠菌群采用97孔定量盘法
本方法取水样100ml，装入100ml的无菌瓶，加入科立得试剂，摇匀使其全部溶解，转入97孔无菌定量盘内，用手抚平定量盘赶出气泡，放入封口机封口。然后放入44.5℃±0.2℃培养箱中培养24h后进行结果判读，如果结果为可疑阴性，可适当延长培养时间到28h，超过28h之后出现的颜色反应不作为阳性结果。将培养24h之后的定量盘取出观察，如果孔穴内的水样变成黄色则表示该孔穴中含有粪大肠菌群（耐热大肠菌群）。计算黄色的孔穴数，对照MPN表查出其代表的粪大肠菌群（耐热大肠菌群）最可能数。
采用Excel软件进行实验数据整理和统计。
3 试验结果和分析
3.1 精密度和准确度检验
采用科立得IDEXX-QC Fecal Coliform质控标样（产品编号98-29001-00，Lot # 122815），分别用快速纸片法和固定底物酶底物法进行平行双样的分析，所得结果均在标准证书所要求的可接受范围内（34-703 MPN/100ml），标准菌株均未出现假阳性或假阴性，相对标准偏差范围为3.2%～4.7%，相对误差范围为-4.2%～3.5%，均在受控范围内。
3.2 水样比对
采用快速纸片法和固定底物酶底物法对50份地表水和废水样品进行分析。为方便作图和统计，將检测结果取lg值来表示，两种方法所测得的粪大肠菌群结果lgMPN值见图1：
对两种方法所得的数据结果进行配对t检验，为了使两组数据成正态分布，先对数据进行取对数后再处理，结果如下：
由上表数据可以看出，相关系数r=0.9019，说明两组数据相关性很好，t=1.985，P值=0.285>0.05，说明两种方法结果差异没有显著意义，可以认为纸片快速法和固定底物酶底物法所得检验结果没有区别，等效。
4 讨论
由表1中检测结果数据可以看出，快速纸片法MPN值较固定底物酶底物法略低，主要原因是固定底物酶底物法的底物为邻硝基苯β-D-半乳吡喃糖苷（ONPG），能够诱导样品中的细菌产生β-半乳糖苷酶，而具有β-半乳糖苷酶是肠杆菌群的重要特征之一[3]，而粪大肠菌群属于肠杆菌群的一种，因此，检测结果会高于纸片快速法。
纸片快速法和固定底物酶底物法均有操作步骤简单，不需要进行确认实验，检测时间短等优点，但是在技术难易和检测费用两个方面来说，快速纸片法检测费用更低，只需购买检测纸片，而固定底物酶底物法需购置封口设备和样品瓶及昂贵的试剂。故纸片快速法更适合现阶段环境监测机构的检测需求。
注意事项：水样在实验前必须充分摇匀，以减少因菌群分布不均匀带来的差异影响。因为要确保实验结果的准确性，同时也是能方便统计，要求水样有一定的阳性检出率，同时，水样的MPN值应尽量控制在2400以内，因为MPN本身为统计得出，如样品中菌数MPN值大于2400，由于样品稀释造成的分配不均导致的差异会比不稀释的样品大很多。
参考文献
[1]朱培瑜，魏轲，固定底物酶底物法与多管发酵法和快速纸片法测定水中粪大肠菌群（耐热大肠菌群）的比较[J].四川环境，2014，33（2）：82.
[2]赵春霞，张哲海.等酶底物法监测环境水样大肠菌群的探讨[J].中国环境科学学术年会论文集，2009.
[3]赵春霞，张哲海.固定底物酶底物法与多管发酵法和纸片法监测环境水样大肠菌群的比较[J].环境监测管理与技术，2009，21（2）：31-32.
收稿日期：2017-05-12
作者简介：傅德瑜，女，2004年毕业于西南石油大学，环境工程专业工程师，研究方向为环境监测。
