观察环境中分离的铜绿假单胞菌噬菌体对烧伤感染小鼠的治疗作用

    张欢欢

    【摘要】目的 观察烧伤感染小鼠环境中分离的铜绿假单胞菌噬菌体的治疗作用。方法 购买郑州大学实验动物中心提供的健康雌性SPF级ICR小鼠，建立烧伤感染模型，观察噬菌体疗效，分析灭活噬菌体的治疗作用、非宿主菌感染小鼠噬菌体的治疗作用，研究噬菌体体内代谢，然后分离鉴定噬菌体，确定细菌最小致死剂量，分析噬菌体Pap-co1治疗效果的时间依赖性、灭活噬菌体Pap-co1疗效、Pap-co2烧伤感染小鼠噬菌体的治疗作用。结果 对烧伤小鼠进行感染，途径为稀释新鲜培养的细菌Pap-co1为1×103-1×108PFU/ml，然后将第2 d、5 d小鼠的生存率选取出来，其中第5 d 1×106-1×108CFU/ml剂量组小鼠均死亡，因此绝对最小致死剂量为1×106CFU/ml。灭活噬菌体组、对照组小鼠第2 d、5 d的生存率80.0%、20.0%，80.0%、0均显著低于正常噬菌体组100.0%、100.0%（P0.05）。Pap-co2组、对照组小鼠第2 d、5 d生存率60.0%、0，80.0%、0均显著低于Pap-co1组100.0%、100.0%（P0.05）。给予小鼠腹腔注射噬菌体Pap-co1后第一时间被吸收，1h内达到最高峰，24h内维持噬菌体浓度在104左右，维持在一定浓度范围内一定时间后逐渐降低。结论 烧伤感染小鼠环境中分离的铜绿假单胞菌宽噬噬菌体的治疗作用明显，同时具有较低的抗原性。

    【关键词】环境中分离;铜绿假单胞菌;噬菌体;烧伤感染小鼠;治疗作用

    【中图分类号】R644 【文献标识码】A 【文章编号】ISSN.2095.6681.2020.21..02

    在医院感染病原菌中，铜绿假单胞菌占有重要地位，在呼吸科革兰阴性菌中位居首位。近年来，铜绿假单胞菌耐药性在大量应用各种广谱抗菌药的作用下日益提升。在我国，在所有医院感染革兰阴性杆菌中，铜绿假单胞菌位居首位，对碳青霉烯类抗生素的耐药性已经在30%以上，具有极为复杂的耐药机制。相关医学统计数据显示[1]，合并铜绿假单胞菌感染的死亡烧伤患者占总数的50%。因此，临床很有必要深入研究噬菌体疗法这一抗感染治疗方法。本研究观察了烧伤感染小鼠环境中分离的铜绿假单胞菌噬菌体的治疗作用。

    1 材料与方法

    1.1 材料

    购买上海新兴化工试剂研究所生产的琼脂粉，杭州天和厂生产的营养琼脂培养基，Amersco公司生产的CsCl，自行配置LB培养液;河南省人民医院检验科分离并鉴定的21株铜绿假单胞菌;从龙湖镇居民生活用水下水道中分离噬菌体，经噬菌斑、电镜观察鉴定。扩增培养噬菌体后离心，途径为经CsCl密度梯度，并纯化、生理盐水稀释，对滴度进行测定，在此过程中将噬菌斑充分利用起来，稀释到1×1010PFU/ml待用，稀释过程中将生理盐水充分利用起来;购买郑州大学实验动物中心提供的健康雌性SPF级ICR小鼠，周龄6～8周，平均（7.0±1.0）周;体重18-22g，平均（20.0±2.0）g。

    1.2 方法

    1.2.1 烧伤感染模型建立

    在10 ml LB培养液中按1：100比例稀释新鲜培养的铜绿假单胞菌，继续培养到对数生长期，浓度为1×108CFU/ml，A50为0.5左右。分实验小组为7组，每组5只，将其背部毛剃掉，面积为小鼠体表面积的10%，直径为2.5 cm的圆形，让小鼠吸入乙醚对其进行麻醉，待其无足趾反射后在鼠夹上固定小鼠，用90℃的热水将其烫伤，持续10 s，为了对烫伤引发的体液丢失进行补充，将0.1 ml不同浓度的铜绿假单胞菌皮下注射到烧伤部位，同时给予其皮下注射0.5 ml生理盐水，将烧伤感染模型建立起来，给予对照组注射等量生理盐水，对小鼠进行5 d观察，将最小致死剂量（LD100）设定为1组小鼠全部死亡的最小剂量，并将其设定为烧伤动物模型的感染剂量。

    1.2.2 噬菌体疗效观察

    分实验小鼠为6组，每组5只，开始计时时间为建立烧伤感染模型后，感染后即刻、3 h、6 h、12 h、24 h分别给予其腹腔注射0.1 ml效价为1×1010PFU/ml的噬菌体。每组均将对照组设置出来，给予其注射等剂量生理盐水，将小鼠生存率记录下来。

    1.2.3 灭活噬菌体的治疗作用分析

    加热噬菌体30 min，条件为在90℃的温度下，效价为1×1010PFU/ml，灭活。分实验小鼠为3组，每组5只，分别给予其注射0.1 ml噬菌体、灭活噬菌体、给予其注射等量生理盐水（对照组），时间为烧伤感染后即刻。

    1.2.4 非宿主菌感染小鼠噬菌体的治疗作用分析

    分实验小鼠为3组，分别给予其注射0.1 ml生理盐水+0.1 ml该噬菌体宿主菌（对照组）、0.1 ml噬菌体+0.1 ml噬菌体宿主菌、0.1 ml噬菌体+0.1 ml噬菌体宿主谱以外的铜绿假单胞菌，时间为烧伤后，将小鼠生存率记录下来。

    1.2.5 噬菌体体内代谢研究

    给予实验小鼠腹腔注射1 ml高浓度噬菌体，时间为开始计时前，分别在第1 h、6 h、12 h、18 h、24 h、30 h、36 h、42 h、48 h将血液从小鼠断尾取出，对噬菌体效价进行测定，在此过程中运用噬菌斑法，重复实验3次，将浓度时间曲线绘制出来。

    1.3 统计学分析

    计数资料用率表示，用x2检验。采用SPSS 21.0，检验水准α=0.05。

    2 結 果

    2.1 噬菌体分离鉴定

    将宿主菌设定为铜绿假单胞菌，将3株铜绿假单胞菌噬菌体从下水道中分离出来，其中宽噬噬菌体1株，电镜观察为短尾噬菌体，直径、尾长分别为45 nm、50 nm，裂解谱、噬菌斑大小分别为6株铜绿假单胞菌、2 mm，命名其为Pap-co1，将1株从6株宿主菌、宿主谱以外的铜绿假单胞菌选取出来，分别命名为Pap-co1、Pap-co2，，在实验研究中应用。