禽传染性支气管炎病毒一步法RT—PCR检测方法的建立及应用

    潘志刚+李军港

    摘要：为建立一种快速检测禽传染性支气管炎病毒（Infectiousbronchitisvirus，IBV）病原的方法，根据GenBank上的禽传染性支气管炎病毒基因组序列，设计1对引物，建立了检测IBV的一步法RT PCR方法，该方法对20份疑似传染性支气管炎（Infectiousbronchitis，IB）病料、传染性法氏囊病毒（Infectiousbursaldiseasevirus，IBDV）、新城疫病毒（Newcastaldiseasevirus，NDV）进行检测，结果仅IBV为阳性，IBDV、NDV均为阴性。该一步法RT PCR方法具有良好的特异性、灵敏性和重复性，最低可检测出约4pg的IBVRNA，将为IBV的病原检测及分子流行病学调查等提供早期快速的诊断方法。

    关键词：禽传染性支气管炎病毒；RT PCR；检测

    中图分类号：S831文献标识码：A文章编号：1007-273X（2014）03-0016-02

    鸡传染性支气管炎（Infectiousbronchitis，IB）是由传染性支气管炎病毒（Infectiousbronchitisvirus，IBV）引起的一种急性、高度接触性传染病，主要侵害鸡的呼吸、泌尿生殖和消化等系统[1]，常给养鸡业带来巨大的经济损失。IBV是单股正链RNA病毒，一般对病毒的扩增都需要先将RNA反转录为cDNA然后再进行PCR扩增，本试验将RT PCR反应中反转录和PCR两个反应所需要的RNA模板、引物等都一次性加到同一个反应管中，同一反应体系中一步完成从反转录到PCR的全部反应，且扩增产物可直接点样电泳，此一步法操作简便，降低操作过程中的污染几率，目前已成为临床上检测和疾病诊断的一个重要发展方向[2]。

    1材料与方法

    1.1病毒

    IBV、IBDV和NDV均由莱山区某公司生物工程中心保存；20份疑似IB病料采自莱山区某养殖场。

    1.2主要试剂

    EasyPureViralDNA/RNAKit和一步法RT PCR检测试剂盒均购自北京全式金生物技术有限公司；其他试剂均为国产分析纯。

    1.3引物设计与合成

    根据GenBank上的禽传染性支气管炎病毒基因组序列设计引物。

    F：5`-GGTATAGTGTGGGTTGCTG-3`，R：3`-CCTTAATACCTTCCTCATTC-5`，扩增片段大小为459bp，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

    1.4病毒的增殖

    经尿囊腔接种0.2mL10倍稀释的IBV，37℃培养，弃去24h内死亡的，72h后收取尿囊液。

    1.5病毒

    RNA的提取参照EasyPureViralDNA/RNAKit说明书进行。

    1.6一步法

    RT PCR的建立采取20 L的反应体系，按照试剂盒介绍的方法进行。在反应体系中分别加入RNA Template1 L，ForwardGSP（10 M）0.4 L，ReverseGSP（10 M）0.4 L，2*One StepReactionMix10 L，TransScriptTMOne StepEnzymeMix0.4 L，RNase freeWater加至总体积20 L，采取的扩增程序为94℃5min；94℃30S，55℃30s，72℃min30个循环；72℃10min，PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。

    1.7特异性试验

    用建立的一步法RT PCR分别检测IBV、IBDV和NDV，验证该方法检测IBV的特异性。

    1.8敏感性验证

    将已定量的IBV毒株提取的RNA进行10倍倍比稀释，稀释度分别为10 1～10 5，用建立的一步法RT PCR进行检测，验证该方法的敏感性。

    1.9田间试验

    采用建立的一步法RT PCR检测方法，对大规模养殖场2013年采集的3批60份样品进行IBV监测，疑似阳性则用鸡胚分离鉴定，然后用IBV抗血清进行中和试验和琼脂扩散试验以鉴定病毒。

    2 结果与分析 2.1 PCR扩增产物的鉴定

    PCR扩增产物经过1%琼脂糖凝胶电泳，在459bp处可见特异性片段，大小与预期相符，见图1。

    2.2特异性的试验结果用建立的一步法

    RT PCR同时检测IBV、IBDV和NDV，仅IBV可扩增出约500bp的目的基因条带，而IBDV和NDV及阴性对照均未扩增出目的片段，见图2。表明该方法特异性较好。

    2.IBDV；3.NDV；4.为阴性对照

    2.3 敏感性的试验结果用建立的一步法

    RT PCR最低可检出稀释度为10 4的病毒RNA，即约4 pg的IBV RNA，见图3。

    2.4田间试验结果

    2013年采集大规模养殖场采集的3批60份样品进行IBV监测，采用所建立的一步法RT PCR检测方法，筛选检测阳性共5份，阳性率为8.33%。样品经鸡胚分离鉴定，然后用IBV抗血清进行中和试验和ELISA试验，结果完全符合。

    3讨论

    近年来，传染性支气管炎病的流行出现了新的特点，其剖检症状不典型，给临床诊断带来很大的困扰，而目前检测IBV的常用实验室方法有病毒分离[3]、琼脂扩散试验[3]、ELISA[4]、RT PCR[5]，这些方法各有优缺点：病原的分离鉴定是临床上诊断IBV的重要方法，但是该方法操作繁琐，检测周期长[6]；琼脂扩撒试验操作简单，但敏感性不高，该方法一般多用于检测IBV抗原，不推荐检测IBV抗体[7]；ELISA检测IBV的优点比一般的血清学试验均敏感，但此法的缺点不能区分抗体是何种毒株刺激机体产生的[1]；RT PCR技术具有灵敏、快速、特异性强、操作简单等特点。

    两步法RT PCR反应一般在PCR仪上先花费1.5h的反转录时间，再停机加入PCR反应试剂进行下一步的PCR反应，操作繁琐，而且花费很多试剂准备试剂、加样。而一步法RT PCR技术只需将反应中反转录和PCR两个反应所需要的RNA模板、引物等都一次性加到同一个反应管中，同一反应体系中一步完成从反转录到PCR的全部反应，且扩增产物可直接点样电泳，此一步法操作简便易行，而且最大限度地降低了外来因素的污染，更适合广大基层大量样品的快速检测。

    本研究根据IBV保守区序列设计1对引物，建立了检测IBV的一步法RT PCR检测方法，结果显示该方法特异性好，灵敏度较高，为今后IB的快速诊断和病原学的研究提供了有力的工具。

    参考文献：

    [1]BW卡尔尼克.禽病学[M].高 福，苏敬良，译.第10版.北京：中国农业大学出版社，1999.

    [2]廖 敏，谢芝勋，谢志勤，等.一步法RT PCR检测禽呼肠孤病毒的研究[J].中国预防兽医学报，2003，25（1）：53 55.

    摘要：为建立一种快速检测禽传染性支气管炎病毒（Infectiousbronchitisvirus，IBV）病原的方法，根据GenBank上的禽传染性支气管炎病毒基因组序列，设计1对引物，建立了检测IBV的一步法RT PCR方法，该方法对20份疑似传染性支气管炎（Infectiousbronchitis，IB）病料、传染性法氏囊病毒（Infectiousbursaldiseasevirus，IBDV）、新城疫病毒（Newcastaldiseasevirus，NDV）进行检测，结果仅IBV为阳性，IBDV、NDV均为阴性。该一步法RT PCR方法具有良好的特异性、灵敏性和重复性，最低可检测出约4pg的IBVRNA，将为IBV的病原检测及分子流行病学调查等提供早期快速的诊断方法。

    关键词：禽传染性支气管炎病毒；RT PCR；检测

    中图分类号：S831文献标识码：A文章编号：1007-273X（2014）03-0016-02

    鸡传染性支气管炎（Infectiousbronchitis，IB）是由传染性支气管炎病毒（Infectiousbronchitisvirus，IBV）引起的一种急性、高度接触性传染病，主要侵害鸡的呼吸、泌尿生殖和消化等系统[1]，常给养鸡业带来巨大的经济损失。IBV是单股正链RNA病毒，一般对病毒的扩增都需要先将RNA反转录为cDNA然后再进行PCR扩增，本试验将RT PCR反应中反转录和PCR两个反应所需要的RNA模板、引物等都一次性加到同一个反应管中，同一反应体系中一步完成从反转录到PCR的全部反应，且扩增产物可直接点样电泳，此一步法操作简便，降低操作过程中的污染几率，目前已成为临床上检测和疾病诊断的一个重要发展方向[2]。

    1材料与方法

    1.1病毒

    IBV、IBDV和NDV均由莱山区某公司生物工程中心保存；20份疑似IB病料采自莱山区某养殖场。

    1.2主要试剂

    EasyPureViralDNA/RNAKit和一步法RT PCR检测试剂盒均购自北京全式金生物技术有限公司；其他试剂均为国产分析纯。

    1.3引物设计与合成

    根据GenBank上的禽传染性支气管炎病毒基因组序列设计引物。

    F：5`-GGTATAGTGTGGGTTGCTG-3`，R：3`-CCTTAATACCTTCCTCATTC-5`，扩增片段大小为459bp，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

    1.4病毒的增殖

    经尿囊腔接种0.2mL10倍稀释的IBV，37℃培养，弃去24h内死亡的，72h后收取尿囊液。

    1.5病毒

    RNA的提取参照EasyPureViralDNA/RNAKit说明书进行。

    1.6一步法

    RT PCR的建立采取20 L的反应体系，按照试剂盒介绍的方法进行。在反应体系中分别加入RNA Template1 L，ForwardGSP（10 M）0.4 L，ReverseGSP（10 M）0.4 L，2*One StepReactionMix10 L，TransScriptTMOne StepEnzymeMix0.4 L，RNase freeWater加至总体积20 L，采取的扩增程序为94℃5min；94℃30S，55℃30s，72℃min30个循环；72℃10min，PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。

    1.7特异性试验

    用建立的一步法RT PCR分别检测IBV、IBDV和NDV，验证该方法检测IBV的特异性。

    1.8敏感性验证

    将已定量的IBV毒株提取的RNA进行10倍倍比稀释，稀释度分别为10 1～10 5，用建立的一步法RT PCR进行检测，验证该方法的敏感性。

    1.9田间试验

    采用建立的一步法RT PCR检测方法，对大规模养殖场2013年采集的3批60份样品进行IBV监测，疑似阳性则用鸡胚分离鉴定，然后用IBV抗血清进行中和试验和琼脂扩散试验以鉴定病毒。

    2 结果与分析 2.1 PCR扩增产物的鉴定

    PCR扩增产物经过1%琼脂糖凝胶电泳，在459bp处可见特异性片段，大小与预期相符，见图1。

    2.2特异性的试验结果用建立的一步法

    RT PCR同时检测IBV、IBDV和NDV，仅IBV可扩增出约500bp的目的基因条带，而IBDV和NDV及阴性对照均未扩增出目的片段，见图2。表明该方法特异性较好。

    2.IBDV；3.NDV；4.为阴性对照

    2.3 敏感性的试验结果用建立的一步法

    RT PCR最低可检出稀释度为10 4的病毒RNA，即约4 pg的IBV RNA，见图3。

    2.4田间试验结果

    2013年采集大规模养殖场采集的3批60份样品进行IBV监测，采用所建立的一步法RT PCR检测方法，筛选检测阳性共5份，阳性率为8.33%。样品经鸡胚分离鉴定，然后用IBV抗血清进行中和试验和ELISA试验，结果完全符合。

    3讨论

    近年来，传染性支气管炎病的流行出现了新的特点，其剖检症状不典型，给临床诊断带来很大的困扰，而目前检测IBV的常用实验室方法有病毒分离[3]、琼脂扩散试验[3]、ELISA[4]、RT PCR[5]，这些方法各有优缺点：病原的分离鉴定是临床上诊断IBV的重要方法，但是该方法操作繁琐，检测周期长[6]；琼脂扩撒试验操作简单，但敏感性不高，该方法一般多用于检测IBV抗原，不推荐检测IBV抗体[7]；ELISA检测IBV的优点比一般的血清学试验均敏感，但此法的缺点不能区分抗体是何种毒株刺激机体产生的[1]；RT PCR技术具有灵敏、快速、特异性强、操作简单等特点。

    两步法RT PCR反应一般在PCR仪上先花费1.5h的反转录时间，再停机加入PCR反应试剂进行下一步的PCR反应，操作繁琐，而且花费很多试剂准备试剂、加样。而一步法RT PCR技术只需将反应中反转录和PCR两个反应所需要的RNA模板、引物等都一次性加到同一个反应管中，同一反应体系中一步完成从反转录到PCR的全部反应，且扩增产物可直接点样电泳，此一步法操作简便易行，而且最大限度地降低了外来因素的污染，更适合广大基层大量样品的快速检测。

    本研究根据IBV保守区序列设计1对引物，建立了检测IBV的一步法RT PCR检测方法，结果显示该方法特异性好，灵敏度较高，为今后IB的快速诊断和病原学的研究提供了有力的工具。

    参考文献：

    [1]BW卡尔尼克.禽病学[M].高 福，苏敬良，译.第10版.北京：中国农业大学出版社，1999.

    [2]廖 敏，谢芝勋，谢志勤，等.一步法RT PCR检测禽呼肠孤病毒的研究[J].中国预防兽医学报，2003，25（1）：53 55.

    摘要：为建立一种快速检测禽传染性支气管炎病毒（Infectiousbronchitisvirus，IBV）病原的方法，根据GenBank上的禽传染性支气管炎病毒基因组序列，设计1对引物，建立了检测IBV的一步法RT PCR方法，该方法对20份疑似传染性支气管炎（Infectiousbronchitis，IB）病料、传染性法氏囊病毒（Infectiousbursaldiseasevirus，IBDV）、新城疫病毒（Newcastaldiseasevirus，NDV）进行检测，结果仅IBV为阳性，IBDV、NDV均为阴性。该一步法RT PCR方法具有良好的特异性、灵敏性和重复性，最低可检测出约4pg的IBVRNA，将为IBV的病原检测及分子流行病学调查等提供早期快速的诊断方法。

    关键词：禽传染性支气管炎病毒；RT PCR；检测

    中图分类号：S831文献标识码：A文章编号：1007-273X（2014）03-0016-02

    鸡传染性支气管炎（Infectiousbronchitis，IB）是由传染性支气管炎病毒（Infectiousbronchitisvirus，IBV）引起的一种急性、高度接触性传染病，主要侵害鸡的呼吸、泌尿生殖和消化等系统[1]，常给养鸡业带来巨大的经济损失。IBV是单股正链RNA病毒，一般对病毒的扩增都需要先将RNA反转录为cDNA然后再进行PCR扩增，本试验将RT PCR反应中反转录和PCR两个反应所需要的RNA模板、引物等都一次性加到同一个反应管中，同一反应体系中一步完成从反转录到PCR的全部反应，且扩增产物可直接点样电泳，此一步法操作简便，降低操作过程中的污染几率，目前已成为临床上检测和疾病诊断的一个重要发展方向[2]。

    1材料与方法

    1.1病毒

    IBV、IBDV和NDV均由莱山区某公司生物工程中心保存；20份疑似IB病料采自莱山区某养殖场。

    1.2主要试剂

    EasyPureViralDNA/RNAKit和一步法RT PCR检测试剂盒均购自北京全式金生物技术有限公司；其他试剂均为国产分析纯。

    1.3引物设计与合成

    根据GenBank上的禽传染性支气管炎病毒基因组序列设计引物。

    F：5`-GGTATAGTGTGGGTTGCTG-3`，R：3`-CCTTAATACCTTCCTCATTC-5`，扩增片段大小为459bp，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

    1.4病毒的增殖

    经尿囊腔接种0.2mL10倍稀释的IBV，37℃培养，弃去24h内死亡的，72h后收取尿囊液。

    1.5病毒

    RNA的提取参照EasyPureViralDNA/RNAKit说明书进行。

    1.6一步法

    RT PCR的建立采取20 L的反应体系，按照试剂盒介绍的方法进行。在反应体系中分别加入RNA Template1 L，ForwardGSP（10 M）0.4 L，ReverseGSP（10 M）0.4 L，2*One StepReactionMix10 L，TransScriptTMOne StepEnzymeMix0.4 L，RNase freeWater加至总体积20 L，采取的扩增程序为94℃5min；94℃30S，55℃30s，72℃min30个循环；72℃10min，PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。

    1.7特异性试验

    用建立的一步法RT PCR分别检测IBV、IBDV和NDV，验证该方法检测IBV的特异性。

    1.8敏感性验证

    将已定量的IBV毒株提取的RNA进行10倍倍比稀释，稀释度分别为10 1～10 5，用建立的一步法RT PCR进行检测，验证该方法的敏感性。

    1.9田间试验

    采用建立的一步法RT PCR检测方法，对大规模养殖场2013年采集的3批60份样品进行IBV监测，疑似阳性则用鸡胚分离鉴定，然后用IBV抗血清进行中和试验和琼脂扩散试验以鉴定病毒。

    2 结果与分析 2.1 PCR扩增产物的鉴定

    PCR扩增产物经过1%琼脂糖凝胶电泳，在459bp处可见特异性片段，大小与预期相符，见图1。

    2.2特异性的试验结果用建立的一步法

    RT PCR同时检测IBV、IBDV和NDV，仅IBV可扩增出约500bp的目的基因条带，而IBDV和NDV及阴性对照均未扩增出目的片段，见图2。表明该方法特异性较好。

    2.IBDV；3.NDV；4.为阴性对照

    2.3 敏感性的试验结果用建立的一步法

    RT PCR最低可检出稀释度为10 4的病毒RNA，即约4 pg的IBV RNA，见图3。

    2.4田间试验结果

    2013年采集大规模养殖场采集的3批60份样品进行IBV监测，采用所建立的一步法RT PCR检测方法，筛选检测阳性共5份，阳性率为8.33%。样品经鸡胚分离鉴定，然后用IBV抗血清进行中和试验和ELISA试验，结果完全符合。

    3讨论

    近年来，传染性支气管炎病的流行出现了新的特点，其剖检症状不典型，给临床诊断带来很大的困扰，而目前检测IBV的常用实验室方法有病毒分离[3]、琼脂扩散试验[3]、ELISA[4]、RT PCR[5]，这些方法各有优缺点：病原的分离鉴定是临床上诊断IBV的重要方法，但是该方法操作繁琐，检测周期长[6]；琼脂扩撒试验操作简单，但敏感性不高，该方法一般多用于检测IBV抗原，不推荐检测IBV抗体[7]；ELISA检测IBV的优点比一般的血清学试验均敏感，但此法的缺点不能区分抗体是何种毒株刺激机体产生的[1]；RT PCR技术具有灵敏、快速、特异性强、操作简单等特点。

    两步法RT PCR反应一般在PCR仪上先花费1.5h的反转录时间，再停机加入PCR反应试剂进行下一步的PCR反应，操作繁琐，而且花费很多试剂准备试剂、加样。而一步法RT PCR技术只需将反应中反转录和PCR两个反应所需要的RNA模板、引物等都一次性加到同一个反应管中，同一反应体系中一步完成从反转录到PCR的全部反应，且扩增产物可直接点样电泳，此一步法操作简便易行，而且最大限度地降低了外来因素的污染，更适合广大基层大量样品的快速检测。

    本研究根据IBV保守区序列设计1对引物，建立了检测IBV的一步法RT PCR检测方法，结果显示该方法特异性好，灵敏度较高，为今后IB的快速诊断和病原学的研究提供了有力的工具。

    参考文献：

    [1]BW卡尔尼克.禽病学[M].高 福，苏敬良，译.第10版.北京：中国农业大学出版社，1999.

    [2]廖 敏，谢芝勋，谢志勤，等.一步法RT PCR检测禽呼肠孤病毒的研究[J].中国预防兽医学报，2003，25（1）：53 55.