湖北省一例猪链球菌的分离与鉴定
高婷 袁芳艳 刘泽文
摘要：从湖北省武汉市江夏区某猪场具有严重呼吸道症状的疑似病例中，通过临床解剖采集猪的脑组织、肺组织、扁桃体组织、关节液等病料进行细菌的分离培养、革兰氏染色、菌落形态观察、PCR鉴定及药敏试验。结果表明，分离到的一株细菌为猪链球菌，经PCR分型鉴定结果为2型猪链球菌，药敏试验显示，该菌对阿莫西林、氨苄西林高度敏感，为猪场用药提供了参考依据。
关键词：猪链球菌；分离；鉴定；耐药性
中图分类号：S858.28 文献标识码：A 文章编号：1007-273X（2018）10-0005-02
猪链球菌（Streptococcus suis，SS）是一种重要的人兽共患传染病的病原菌，其不仅可以感染猪导致败血症、肺炎、脑膜炎、关节炎以及心内膜炎等，引起断奶仔猪或育肥猪死亡，给养猪业造成重大的经济损失，还可以感染人导致败血症型休克甚至死亡，严重威胁着人类的身体健康和生命安全[1，2]。本研究对湖北省武汉市江夏区某猪场采集了疑似病猪的脑、肺脏、扁桃体、关节液等病料，进行了细菌分离培养及鉴定，通过分型及药敏试验，初步了解了该猪场链球菌病发病情况，筛选出了高敏感藥物，为猪场临床用药选择以及接种与血清型相符的疫苗进行预防提供了参考依据。
1 材料与方法
1.1 病料采集
从湖北省武汉市江夏区某猪场采集发病猪的脑、肺脏、扁桃体、关节液等病料。
1.2 培养基及试剂
胰蛋白大豆琼脂（TSA）购自Difco公司；革兰氏染色液购自珠海贝索生物技术有限公司；新生牛血清购自浙江天杭生物科技股份有限公司；无菌脱纤绵羊血均购自南京茂捷微生物科技有限公司；药敏纸片购自北京天坛药物生物技术开发公司；2×Taq mix、2 000 DNA Marker均购自宝生物工程（大连）有限公司。
1.3 培养基的配置
TSA固体培养基：取TSA培养基粉末4 g，溶于100 mL超纯水中，115 ℃灭菌15 min，冷却至50 ℃加新生牛血清10 mL，倾倒平皿，4 ℃保存备用。血平皿：TSA固体培养基灭菌后冷却至50 ℃加无菌脱纤绵羊血10 mL，倾倒平皿，4 ℃保存备用[3]。
1.4 细菌分离鉴定
1.4.1 细菌的分离培养 无菌采取猪病料均匀涂布于血平皿培养基上，37 ℃温箱中培养12 h后，挑选可疑单个链球菌菌落纯化，37 ℃培养12 h，观察细菌的生长情况。
1.4.2 镜检 挑取TSA平板上的单菌落，革兰氏染色后用光学显微镜观察细菌的颜色和形态[4]。
1.4.3 生化鉴定 挑取TSA平板上的单菌落，摇菌培养至对数期，将菌液接种乳糖、甘露醇、山梨醇、蔗糖、葡萄糖和麦芽糖等生化鉴定管，置于37 ℃培养24 h，观察结果。
1.4.4 PCR分型 参照文献设计猪链球菌与猪链球菌2型特异性引物[5，6]，用于猪链球菌的鉴定和分型，引物序列见表1。挑取疑似SS并纯化的单菌落裂解，作为PCR扩增的模板，空白对照用等体积的去离子水代替模板，阳性对照为实验室保存的2型猪链球菌。
1.5 药敏试验
将分离纯化的菌株按常规方法进行药敏试验。
2 结果与分析
2.1 细菌的形态特征
分离到的细菌在加血清的TSA上菌落呈半透明、光滑、圆形突起的细小菌落，顺着光线看去菌落泛着蓝光。在血平板上可见生长均一的细菌，菌落周围有α溶血环。革兰氏染色为革兰氏阳性菌，卵圆形，链状，链的长短由2～5个球菌组成。
2.2 生化鉴定结果
生化鉴定结果显示，分离的疑似菌脲酶试验、氧化酶试验、吲哚试验、M-R 试验、V-P试验、触酶试验均为阴性；发酵葡萄糖、蔗糖、果糖、海藻糖、乳糖、麦芽糖、棉实糖、七叶苷、水杨苷等碳水化合物；不发酵木糖、山梨醇、甘露醇、阿拉伯糖、菊糖；符合猪链球菌的生化特征。
2.3 PCR扩增结果
PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果显示，用猪链球菌特异性基因16srRNA的引物能扩出目的条带，标准猪链球菌和分离株均在1 066 bp处（图2）；用2型猪链球菌特异性基因cps2J的引物能扩出目的条带，标准猪链球菌和分离株均在557 bp处（图2），与预期片段一致，测序与猪链球菌SC19序列一致，证明所分离菌株为2型猪链球菌。
2.4 药敏试验结果
对分离的2型猪链球菌进行了14种抗菌药物的耐药性试验，结果显示，分离菌株对强力霉素、卡那霉素、四环素、林可霉素、头孢曲松、阿米卡星、庆大霉素、头孢噻肟等产生耐药性，对环丙沙星、阿莫西林和氨苄西林药物高度敏感（表2），临床上可用该药对发病猪进行治疗。
3 讨论
根据荚膜多糖的差异，猪链球菌可分为33个血清型[7，8]，其中2型是毒力最强的优势血清型[2，5，7，9，10]，其不仅可以感染猪导致败血症、肺炎、脑膜炎、关节炎以及心内膜炎等，引起断奶仔猪或者育肥猪死亡，给养猪业造成重大的经济损失，还可以感染人导致败血症型休克甚至死亡，严重威胁着人类的身体健康和生命安全[1]。本研究从湖北省武汉市江夏区某猪场分离出一株细菌，经革兰氏染色确定为革兰氏阳性菌，随后采用生化鉴定方法和PCR技术，证实该菌为2型猪链球菌。药敏试验结果显示，2型猪链菌对强力霉素、卡那霉素、四环素、林可霉素、头孢曲松、阿米卡星、庆大霉素、头孢噻肟产生耐药性，对环丙沙星、阿莫西林和氨苄西林药物高度敏感。临床上，建议采用药敏试验筛选出高敏感药物进行治疗，可很大程度上改善病情，并建议在生产实践中注射含有2型猪链球菌的多价疫苗，以期更好地预防猪链球菌病的发生和流行。
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